In the motor neuron-like MN1 cells,

In the motor neuron-like MN1 cells, expression from all viruses was equal and approximately 10-fold higher than background, but the overall level of β-gal activity was approximately 10- to 100-fold lower than that observed in A549 cells (Fig. 2B). This latter observation is consistent with the apparent developmental down-regulation of CAR expression in spinal cord of mice (Hotta et al., 2003) and with our previous data showing that Ad5 does not infect MN1 cells well (Goulet et al., 2013b). Addition of the pK motif on the Ad5S knob did not enhance infection of MN1 cells. Similar to A549 cells, viruses infected both undifferentiated and differentiated C2C12 cells with very high efficiency, and cells treated with the vector containing the native Ad fibre showed an approximately 10 fold higher level of β-gal activity than the other viruses (Fig. 2C and D).

Virus infection in vivo
To examine whether reducing the length of fibre protein, and thus the overall size of the virus, enhanced extravasation into surrounding tissue, we evaluated β-galactosidase expression in liver (a site for high level uptake of virus, regardless of injection route) and in TA muscle by chemiluminescence activity assay (Fig. 3). We used three doses of virus: 5×1011 VP/kg (low), 1×1012 VP/kg (middle) and 5×1012 VP/kg (high), and either IP or IV injection. As a control, we injected the TA muscle directly with the highest dose of the three viruses. The data shows that the viruses were capable of infecting muscle and gave rise to very high levels of β-galactosidase activity (Fig. 3A). Of note, when normalised to the amount of protein in the sample, after direct TA muscle injection, approximately 20% of the β-gal activity was detected in the liver (Fig. 3B), suggesting there is significant escape from the site of injection to the liver. IP injection of the three viruses led to only a modest increase in β-gal activity in the TA muscle at the highest virus dose (Fig. 3C), and a dose dependent increase in expression in the liver for Ad5SlacZ and Ad5LlacZ (Fig. 3D). Interestingly, after IP injection, no liver expression was observed for Ad5SpKlacZ, regardless of dose, suggesting that the virus may efficiently and preferentially infect the peritoneum and is not available for infection elsewhere. IV injection of the viruses did not result in a significant increase in β-gal activity in the TA muscle, with the exception of the highest dose of Ad5LlacZ (Fig. 3E). For all viruses, following IV injection there was a significant dose-dependent increase in β-gal activity in the liver of treated animals, with an approximately equal level of expression for all viruses (Fig. 3F).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในเซลล์ประสาทเหมือน MN1 นิพจน์จากไวรัสทั้งหมดเท่า และประมาณ 10-fold สูงกว่าพื้นหลัง แต่ระดับโดยรวมของกิจกรรมβ gal ประมาณ 10 - ถึง 100 - fold มากกว่าที่พบในเซลล์ A549 (Fig. 2B) สังเกตหลังนี้มีความสอดคล้องชัดเจนพัฒนาลงข้อบังคับค่ารถในสันหลังของหนู (Hotta et al., 2003) และก่อนหน้าข้อมูลแสดงว่า Ad5 ไม่ติดเชื้อเซลล์ MN1 ดี (Goulet et al., 2013b) แปลน pK บนปุ่ม Ad5S เพิ่มไม่เพิ่มเชื้อเซลล์ MN1 เช่นเดียวกับเซลล์ A549 ติดเชื้อไวรัสทั้ง undifferentiated กแยกแยะเซลล์ C2C12 มีประสิทธิภาพสูง และเซลล์รับเวกเตอร์ที่ประกอบด้วยเส้นใยโฆษณาพื้นเมืองที่แสดงให้เห็นว่าการพับประมาณ 10 มีระดับสูงของβ-gal กิจกรรมกว่าอื่น ๆ ไวรัส (Fig. 2C และ D)การติดเชื้อไวรัสในสัตว์ทดลองตรวจสอบว่าการลดความยาวของเส้นใย โปรตีน และดังขนาดโดยรวมของไวรัส extravasation เพิ่มเข้าไปในเนื้อเยื่อที่อยู่โดยรอบ เราประเมินนิพจน์β-galactosidase ในตับ (ไซต์สำหรับดูดซับระดับสูงของไวรัส ไม่ฉีดเส้น) และกล้ามเนื้อตา โดยวิเคราะห์กิจกรรม chemiluminescence (Fig. 3) เราใช้สามปริมาณไวรัส: 5 × 1011 VP/kg (ต่ำ), 1 × 1012 VP/kg (กลาง) และ 5 × 1012 VP/kg (สูง), และ IP หรือ IV ฉีด เป็นตัวควบคุม เราฉีดกล้ามเนื้อตาโดยตรงกับปริมาณสูงสุดของไวรัส 3 ข้อมูลแสดงว่า ไวรัสมีความสามารถในการติดกล้ามเนื้อ และให้ระดับสูงของβ-galactosidase กิจกรรม (Fig. 3A) ตั๋ว เมื่อ normalised จำนวนโปรตีนในตัวอย่าง หลังตรงตากล้ามเนื้อฉีด ประมาณ 20% ของกิจกรรมβ gal พบในตับ (Fig. 3B), แนะนำมีหนีสำคัญจากเว็บไซต์ของการฉีดที่ตับ นำ IP ฉีดไวรัส 3 เท่าเพิ่มเจียมเนื้อเจียมตัวในกิจกรรมβ gal ในกล้ามเนื้อตาที่ปริมาณไวรัสสูงที่สุด (Fig. 3C), และการเพิ่มขึ้นขึ้นอยู่กับปริมาณในนิพจน์ในตับสำหรับ Ad5SlacZ และ Ad5LlacZ (Fig. 3D) เป็นเรื่องน่าสนใจ หลังจากที่ฉีด IP นิพจน์ไม่ตับถูกสังเกตสำหรับ Ad5SpKlacZ ไม่ยา การแนะนำว่า ไวรัสอาจมีประสิทธิภาพ และโน้ตติด peritoneum และไม่มีการติดเชื้ออื่น ๆ ฉีด IV ไวรัสผลไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมβ gal ในกล้ามเนื้อตา ยกเว้นปริมาณสูงสุดของ Ad5LlacZ (Fig. 3E) ไวรัสทั้งหมด ฉีด IV มีต่อไปนี้ถูกเพิ่มขึ้นอยู่กับปริมาณรังสีสำคัญกิจกรรมβ gal ในตับของสัตว์บำบัด การเท่ากันโดยประมาณด้วยนิพจน์สำหรับไวรัสทั้งหมด (Fig. 3F)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในมอเตอร์เซลล์ประสาทเหมือน MN1 เซลล์แสดงออกจากไวรัสทั้งหมดเท่ากับประมาณ 10 เท่าสูงกว่าพื้นหลัง แต่ระดับโดยรวมของกิจกรรมβ-gal อยู่ที่ประมาณ 10 ถึง 100 เท่าต่ำกว่าที่พบในเซลล์ A549 (รูปที่ . 2B) การสังเกตนี้หลังมีความสอดคล้องกับการพัฒนาที่ชัดเจนลงควบคุมการแสดงออกของรถในไขสันหลังของหนู (ฮอทต้า et al., 2003) และข้อมูลก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า Ad5 ไม่ได้ติดเชื้อเซลล์ MN1 ดี (Goulet et al., 2013b) . นอกเหนือจากบรรทัดฐานเภสัชจลนศาสตร์ในลูกบิด Ad5S ไม่ได้ช่วยเพิ่มการติดเชื้อของเซลล์ MN1 คล้ายกับเซลล์ A549 ไวรัสที่ติดเชื้อทั้งเซลล์ C2C12 ความแตกต่างและความแตกต่างได้อย่างมีประสิทธิภาพสูงมากและเซลล์รับการรักษาด้วยเวกเตอร์ที่มีใยโฆษณาพื้นเมืองแสดงให้เห็นว่าระดับประมาณ 10 เท่าสูงขึ้นของกิจกรรมβ-แกลลอนกว่าไวรัสอื่น ๆ (รูป. 2C และ D). การติดเชื้อไวรัสในร่างกายเพื่อตรวจสอบว่าการลดความยาวของเส้นใยโปรตีนและทำให้ขนาดโดยรวมของไวรัส extravasation เพิ่มเข้าไปในเนื้อเยื่อรอบเราประเมินการแสดงออกβ-galactosidase ในตับ (เว็บไซต์สำหรับการดูดซึมระดับสูงของไวรัส โดยไม่คำนึงถึงเส้นทางการฉีด) และกล้ามเนื้อตาด้วยวิธีกิจกรรม chemiluminescence (รูปที่. 3) เราใช้สามปริมาณของไวรัส: 5 × 1,011 VP / kg (ต่ำ), 1 × 1,012 VP / กก. (กลาง) และ 5 × 1,012 VP / กก. (สูง) และทั้งการฉีด IP หรือ IV ในขณะที่การควบคุมเราฉีดกล้ามเนื้อ TA โดยตรงกับปริมาณสูงสุดของทั้งสามไวรัส ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าไวรัสมีความสามารถในการติดไวรัสกล้ามเนื้อและให้ขึ้นไปอยู่ในระดับที่สูงมากของกิจกรรมβ-galactosidase (รูป. 3A) โน้ตเมื่อปกติปริมาณของโปรตีนในตัวอย่างหลังจากการฉีดกล้ามเนื้อ TA โดยตรงประมาณ 20% ของกิจกรรมβ-gal ถูกตรวจพบในตับ (รูป. 3B) ชี้ให้เห็นว่ามีการหลบหนีอย่างมีนัยสำคัญจากบริเวณที่ฉีด ไปที่ตับ การฉีดไอพีของทั้งสามไวรัสนำไปสู่การเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยในกิจกรรมβ-แกลลอนในกล้ามเนื้อตาที่ปริมาณไวรัสมากที่สุด (รูป. 3C) และมีปริมาณเพิ่มขึ้นในการแสดงออกในตับสำหรับ Ad5SlacZ และ Ad5LlacZ (รูป. 3D ) ที่น่าสนใจหลังจากการฉีดไอพีแสดงออกตับไม่เป็นที่สังเกตสำหรับ Ad5SpKlacZ โดยไม่คำนึงถึงปริมาณที่ชี้ให้เห็นว่าไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพและพิเศษอาจติดเชื้อเยื่อบุช่องท้องและไม่สามารถใช้ได้กับการติดเชื้ออื่น ๆ ฉีด IV ของไวรัสไม่ได้ผลในการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมβ-แกลลอนในกล้ามเนื้อ TA มีข้อยกเว้นของปริมาณสูงสุดของ Ad5LlacZ (รูป. 3E) หาไวรัสทั้งหมดต่อไปนี้การฉีด IV มีการเพิ่มขึ้นขึ้นอยู่กับปริมาณที่มีนัยสำคัญในกิจกรรมβ-แกลลอนในตับของสัตว์ที่ได้รับการรักษาที่มีระดับเท่ากันโดยประมาณในการแสดงออกเพื่อหาไวรัสทั้งหมด (รูป. 3F)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในเซลล์ประสาทสั่งการ เช่น mn1 เซลล์ การแสดงออกจากไวรัสทั้งหมดเท่ากับประมาณ 10 เท่า และสูงกว่าพื้นหลัง แต่ระดับโดยรวมของบีตา - กิจกรรม gal ประมาณ 10 - 100 เท่า ต่ำกว่าที่พบใน a549 เซลล์ ( รูปที่ 2B ) สังเกตหลังนี้สอดคล้องกับพัฒนาการที่ชัดเจนของรถ down-regulation การแสดงออกในไขสันหลังของหนู ( โฮตตะ et al . ,2546 ) และก่อนหน้าของเราแสดงให้เห็นว่าข้อมูล ad5 ไม่ติด mn1 เซลล์ดี ( goulet et al . , 2013b ) เพิ่มของ PK แรงจูงใจใน ad5s ลูกบิดไม่ได้เพิ่มการติดเชื้อของ mn1 เซลล์ คล้ายกับ a549 เซลล์ , ไวรัสที่ติดเชื้อทั้งไม่แตกต่างกันและแตกต่าง c2c12 เซลล์ที่มีประสิทธิภาพสูงมากและเซลล์ที่ได้รับเวกเตอร์ที่มีเส้นใยโฆษณาพื้นเมืองแสดงพับประมาณ 10 ระดับของบีตา - Gal กิจกรรมกว่าไวรัสอื่นๆ ( รูปที่ 2 C และ D )


เพื่อตรวจสอบการติดเชื้อไวรัสในร่างกาย ไม่ว่าการลดความยาวของเส้นใยโปรตีน และทำให้ขนาดโดยรวมของไวรัส เพิ่ม extravasation ในรอบ เนื้อเยื่อเราประเมินการแสดงออกบีตา - galactosidase ในตับ ( เว็บไซต์สำหรับการใช้ระดับของไวรัส ไม่ว่าเส้นทางการฉีด ) และตา กล้ามเนื้อ โดยนโยบายแรงงานกิจกรรม assay ( รูปที่ 3 ) เราใช้สามหลอดไวรัส : 5 ×คุณ VP / kg ( ต่ำ ) , 1 × 1012 VP / kg ( กลาง ) และ 5 × 1012 VP / กิโลกรัม ( สูง ) และทั้ง IP หรือฉีด IV เป็นตัวควบคุมเราฉีดทากล้ามเนื้อโดยตรงกับปริมาณสูงสุดของทั้งสามไวรัส จากข้อมูลพบว่า ไวรัสมีความสามารถในการติดกล้ามเนื้อและให้สูงขึ้นไประดับที่สูงมากของบีตา - galactosidase activity ( รูปที่ 3 ) หมายเหตุ เมื่อผลกำไรกับปริมาณของโปรตีนในตัวอย่างหลังจากฉีดตรงกล้ามเนื้อตา ประมาณ 20% ของบีตา - กิจกรรมเด็กที่ตรวจพบในตับ ( รูปที่ 3B )แนะนำให้มีการหลบหนีที่สําคัญจากเว็บไซต์ของการฉีดไปที่ตับ IP ฉีดสามไวรัสเป็นเพียงเจียมเนื้อเจียมตัวเพิ่มบีตา - Gal กิจกรรมในท่ากล้ามเนื้อที่ปริมาณไวรัสมากที่สุด ( รูปที่ 3 ) และเพิ่มปริมาณขึ้นในการแสดงออกในตับและใน ad5slacz ad5llacz ( รูปที่ 3 ) ทั้งนี้ หลังจากฉีดไอพี ไม่แสดงออกว่า ad5spklacz ตับ ,