As we pondered on potential separat

As we pondered on potential separation strategies, we con- cluded that the method should optimally consist of as few steps as possible, use environmentally and toxicologically benign sol- vents so the isolated materials could be used for human studies, and that the resulting method should be suitable for laboratory use as well as scalable to an industrial level for use by the food or nutraceutical industry. Combining these requirements with
our previous successes (Breksa & Manners, 2004) with separating LARL from limonin using a C-18 SPE resin and the structural differ- ences between limonin and limonin glucoside (Fig. 1) affording dif- ferences in their water solubility, specifically the increased water solubility of limonin glucoside resulting from opening of the D-ring lactone and the attachment of a glucose moiety, we believed that C-18 reversed-phase chromatography would be the method of choice. Accordingly, we first evaluated the removal of limonin from a saturated solution of limonin glucoside on a small scale using a strategy analogous to the non-retentive method used for the sepa- ration of limonoate A-ring lactone from limonin. Having obtained positive results using this strategy, we sought to extrapolate the method to a larger scale and through-put by developing a contin- uous extraction method for removing limonin present in a solid sample of limonin glucoside. For this method, a sample was contin- uously extracted with an ethanol–water mixture, the resulting li- quid extract was passed through a self-packed C-18 SPE column to trap the solubulized limonin and then returned back to be used again to extract additional limonin from the sample. In testing this strategy we found by HPLC analysis that the initial eluates from the column were devoid of limonin, but contained limonin glucoside. As the extraction process continued, the limonin concentration in the eluate became detectable and increased until it reached a pla- teau suggesting that the column had been saturated. We fully ex- pected to find only limonin upon eluting the C-18 column with 100% EtOH, but were surprised to find both limonin glucoside and limonin were present. This result lead to the conclusion that under the conditions used, a steady-state had been reached be- tween the column and solution and that the continuous extraction strategy would need to be abandoned.
We then turned our attention to a discontinuous chromato- graphic approach and began experiments to evaluate the separa- tion by C-18 flash chromatography. The separation of limonoid glucosides by C-18 flash chromatography has been reported (Ra- man, Cho, Brodbelt, & Patil, 2005), but not for the separation of limonoid aglycones from glucosides. Using a Biotage C-18 scaling column and continuing with the choice of EtOH and H2O as inex- pensive and toxicologically benign solvents, experiments were conducted to determine the solvent ratio for the optimal resolution of limonin glucoside (1) and limonin (2). We found that at 15% EtOH, 2 was either fully retained whereas with increasing EtOH concentrations (20–50%) 2 was eluted with increasing efficiency as judged by a reduction in its retention time and peak width. Thus these observations demonstrated that the desired separation was achievable with a simple step gradient in which 1 was eluted with 15% EtOH and 2 was subsequently eluted with 50% EtOH and were equally encouraging considering that C-18 flash columns are avail- able on preparatory and industrial scale and that a stepwise elution with only two pre-mixed solvents is easier to accomplish on an industrial scale than a gradient requiring method.
In continuing with the strategy to chromatographically resolve 1 and 2 by C-18 flash chromatography, we went from mg to deci- gram processing capacity as we progressed from 12 M to 75 L col- umn sizes. As described in the Section 2, scaling conditions were initiated using the column manufacturer’s recommend scaling fac- tors, but were ultimately optimised based on empirical observa- tions and the overriding desire to minimise solvent composition and process time without compromising chromatographic resolu- tion. The finalised conditions for each scale are shown in Table 1 and an example chromatogram from a 75 L run using the finalised conditions is shown in Fig. 2.
The chromatogram shows recorded run times and ignores down times for adding solvents to the solvent tank, or removing remain- ing sample solution from it after step 2. The chromatogram shows three peaks. A baseline rise was noted even before the first litre (one column volume) eluted at ca. 18min, and collection of

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในฐานะที่เราครุ่นคิดเกี่ยวกับกลยุทธ์การแยกที่อาจเกิดขึ้นเราจะประกอบด้วย cluded ว่าวิธีการที่ดีที่สุดควรประกอบด้วยขั้นตอนน้อยที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ใช้สิ่งแวดล้อมและช่องระบายอากาศที่เป็นพิษเป็นภัย Sol- พิษเพื่อแยกวัสดุที่สามารถนำมาใช้สำหรับการศึกษาของมนุษย์และว่าวิธีการที่เกิดขึ้นควร เหมาะสำหรับการใช้งานในห้องปฏิบัติการเช่นเดียวกับการขยายขีดความสามารถให้อยู่ในระดับอุตสาหกรรมเพื่อใช้สำหรับอุตสาหกรรมอาหาร nutraceutical รวมความต้องการเหล่านี้กับ
ความสำเร็จของเราก่อนหน้า (Breksa และมารยาท, 2004) ที่มีการแยก LARL จาก limonin ใช้เรซิน SPE C-18 และความแตกต่างระหว่างโครงสร้างและ limonin limonin glucoside (รูปที่ 1). เจตนารมณ์ ferences ต่างกันในการละลายน้ำของพวกเขา โดยเฉพาะการละลายน้ำที่เพิ่มขึ้นของ glucoside limonin เป็นผลมาจากการเปิดตัวของ D-lactone แหวนและสิ่งที่แนบมาของน้ำตาลกลูโคสครึ่งหนึ่งที่เราเชื่อว่า C-18 โคกลับเฟสจะมีวิธีการเลือก ดังนั้นเราประเมินการกำจัดของ limonin จากสารละลายอิ่มตัวของ glucoside limonin ในขนาดเล็กใช้กลยุทธ์คล้ายคลึงกับวิธีการที่ไม่ยึดที่ใช้สำหรับการปันส่วนแยกของ limonoate lactone แหวนจาก limonin มีผลในเชิงบวกได้ใช้กลยุทธ์นี้เราพยายามที่จะคาดการณ์วิธีการที่จะมีขนาดใหญ่และผ่านการใส่โดยการพัฒนาวิธีการสกัด contin- uous สำหรับการลบ limonin อยู่ในตัวอย่างมั่นคงของ limonin glucoside สำหรับวิธีนี้ตัวอย่าง contin- uously สกัดด้วยเอทานอลผสมน้ำผลของสารสกัดจากชาน li- ก็ผ่านไปผ่านคอลัมน์ตัวเองเต็มไป C-18 SPE ดัก limonin solubulized แล้วกลับถูกนำมาใช้อีกครั้งเพื่อ สารสกัดจาก limonin เพิ่มเติมจากตัวอย่าง ในการทดสอบกลยุทธ์นี้เราพบว่าโดยการวิเคราะห์ HPLC ที่ eluates เริ่มต้นจากคอลัมน์เป็นไร้ limonin แต่มี limonin glucoside ในฐานะที่เป็นกระบวนการสกัดยังคงความเข้มข้นใน limonin eluate กลายเป็นที่ตรวจพบและเพิ่มขึ้นจนกว่าจะถึง teau pla- บอกว่าคอลัมน์ที่ได้รับการอิ่มตัว เราไม่คาดคิดได้อย่างเต็มที่ที่จะหาอดีตเท่านั้น limonin เมื่อ eluting คอลัมน์ C-18 100% EtOH แต่ประหลาดใจที่พบทั้ง glucoside limonin และ limonin อยู่ในปัจจุบัน นำผลที่ได้นี้ไปสู่ข้อสรุปว่าภายใต้เงื่อนไขที่ใช้รัฐอย่างต่อเนื่องมาถึงโดยสลับทวีคอลัมน์และวิธีการแก้ปัญหาและกลยุทธ์การสกัดอย่างต่อเนื่องจะต้องถูกยกเลิก.
จากนั้นเราหันความสนใจของเราที่จะไม่ต่อเนื่องวิธีกราฟิก chromato- และเริ่มการทดลองเพื่อประเมินการ separa- โดยโคแฟลช C-18 แยก glucosides limonoid โดยโคแฟลช C-18 ได้รับรายงาน (ชาย Ra-, โช Brodbelt และพาติล, 2005) แต่ไม่ได้สำหรับการแยก aglycones limonoid จาก glucosides ใช้คอลัมน์ปรับ BIOTAGE C-18 และต่อเนื่องกับทางเลือกของ EtOH H2O และตัวทำละลายเป็น inex- หม่นและอ่อนโยนพิษทดลองได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบอัตราการทำละลายสำหรับการแก้ปัญหาที่ดีที่สุดของ limonin glucoside (1) และ limonin (2) เราพบว่า 15% EtOH 2 ได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างเต็มที่ทั้งในขณะที่มีการเพิ่มความเข้มข้นของเอทานอล (20-50%) 2 ชะอย่างมีประสิทธิภาพเพิ่มขึ้นตามการตัดสินโดยการลดเวลาในการเก็บรักษาและความกว้างสูงสุดของ ดังนั้นการสังเกตเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการแยกที่ต้องการก็ทำได้ด้วยการไล่ระดับสีขั้นตอนง่ายๆที่ 1 ชะกับ 15% EtOH และ 2 ชะต่อมา 50% EtOH และให้กำลังใจอย่างเท่าเทียมกันพิจารณาว่าคอลัมน์แฟลช C-18 มีความรุนแรงทางเพศสามารถในการเตรียมความพร้อม และระดับอุตสาหกรรมและชะแบบขั้นตอนที่มีเพียงสองตัวทำละลายก่อนผสมเป็นเรื่องง่ายที่จะประสบความสำเร็จในระดับอุตสาหกรรมกว่าวิธีการไล่ระดับสีที่ต้องการ.
ในต่อเนื่องกับกลยุทธ์ที่ใช้ในการแก้ไข chromatographically ที่ 1 และ 2 โดยโคแฟลช C-18 เราเดินออกมาจาก มก. เพื่อ deci- กำลังการผลิตกรัมในขณะที่เราก้าวหน้าจาก 12 M 75 L จะเก็บรวบรวมขนาด UMN ตามที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 2 ปรับสภาพถูกริเริ่มโดยใช้ขอแนะนำให้ผู้ผลิตปรับคอลัมน์ tors fac- แต่ที่ดีที่สุดในท้ายที่สุดขึ้นอยู่กับข้อ observa- เชิงประจักษ์และความปรารถนาที่จะลดความสำคัญองค์ประกอบตัวทำละลายและระยะเวลาดำเนินการโดยไม่สูญเสียความละเอียดโครการ สรุปเงื่อนไขสำหรับแต่ละขนาดจะแสดงในตารางที่ 1 และตัวอย่าง chromatogram จากระยะ 75 ลิตรโดยใช้เงื่อนไขสรุปแสดงในรูป 2.
chromatogram แสดงให้เห็นถึงการบันทึกเวลาการทำงานและไม่สนใจลงครั้งสำหรับการเพิ่มตัวทำละลายกับถังตัวทำละลายหรือถอด remain- ไอเอ็นจีแก้ปัญหาตัวอย่างจากมันหลังจากขั้นตอนที่ 2 แสดงให้เห็น chromatogram สามยอด เพิ่มขึ้นพื้นฐานก็สังเกตเห็นแม้กระทั่งก่อนที่แรกลิตร (ปริมาณหนึ่งคอลัมน์) ชะที่แคลิฟอร์เนีย 18min และคอลเลกชันของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อเราคิดเกี่ยวกับกลยุทธ์การแยกที่มีศักยภาพ เรา con - cluded วิธีการที่เหมาะสมควรประกอบด้วยขั้นตอนน้อยเป็นไปได้ ใช้กับสิ่งแวดล้อมและ toxicologically ใจดี โซล - ช่องระบายอากาศเพื่อแยกวัสดุที่สามารถใช้สำหรับมนุษย์การศึกษาและนั่นส่งผลให้วิธีการที่ควรจะเหมาะสำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการ รวมทั้งปรับขนาดได้ถึงระดับอุตสาหกรรม เพื่อใช้อาหารหรืออุตสาหกรรม Nutraceutical . รวมความต้องการเหล่านี้กับ
ความสำเร็จก่อนหน้านี้ ( breksa &มารยาท , 2004 ) กับการแยกจากการ larl ิน - สารเรซินและโครงสร้างแตกต่าง - ences ินินกลูโคไซด์ ( รูปและระหว่าง1 ) affording DIF - ferences ในการดูดซึมน้ำของตนเอง โดยเฉพาะการเพิ่มการละลายของน้ำและลิโมนินที่เกิดจากการเปิดของ D - แหวนหัว lactone และสิ่งที่แนบมาของกลูโคสที่แน่นอน เราเชื่อว่า reversed-phase โครมาโทกราฟี - น่าจะเป็นวิธีเลือก ตามเราประเมินการกำจัดลิโมนินจากสารละลายอิ่มตัวของลิโมนีน กลูโคไซด์ในขนาดเล็กโดยใช้กลยุทธ์ที่คล้ายคลึงกับที่ไม่ใช้วิธีการจัดเก็บสำหรับอาหารของ limonoate เสภา - a-ring แลคโตนจากิน . ได้รับผลลัพธ์ที่เป็นบวก โดยใช้กลยุทธ์นี้เราพยายามที่จะคาดการณ์วิธีการขนาดใหญ่และผ่านการวางโดยการพัฒนา Contin - วิธีการสกัด uous เอาลิโมนินที่มีอยู่ในตัวอย่างของแข็งของลิโมนินกลูโคไซด์ สำหรับวิธีนี้จำนวน Contin - uously สกัดด้วยเอทานอลและน้ำผสมกันส่งผลให้หลี่ - เควดสกัดได้ผ่านตนเองคอลัมน์ SPE - กับดักิน solubulized แล้วกลับมาใช้อีกครั้ง เพื่อสกัดลิโมนินเพิ่มเติมจากตัวอย่าง ในการทดสอบกลยุทธ์นี้เราพบโดยการวิเคราะห์ HPLC ที่ eluates ครั้งแรกจากคอลัมน์ขาดิน แต่ที่มีอยู่ลิโมนินกลูโคไซด์ เป็นขั้นตอนการสกัดอย่างต่อเนื่องินความเข้มข้นในสารละลาย ( eluate ) และกลายเป็นได้เพิ่มขึ้น จนมันถึงปลา - teau แนะนำว่า คอลัมน์ที่ได้รับการอิ่มตัว เราเต็มที่ อดีต pected จะพบได้เฉพาะบน - hexane ินที่คอลัมน์ที่มีแอลกอฮอล์ 100% แต่แปลกใจที่เจอินิน ( ทั้งสองและเป็นปัจจุบัน ผลนี้นำไปสู่ข้อสรุปว่าภายใต้เงื่อนไขใช้เป็นสภาวะคงตัวได้ถึง - นคอลัมน์และโซลูชั่น และว่า ยุทธศาสตร์การสกัดแบบต่อเนื่องจะต้องถูกทิ้ง แล้วหันความสนใจของเรา
เราเพื่อความ chromato กราฟิก -- วิธีการและเริ่มทดลองเพื่อประเมิน separa - tion - แฟลชโดยโครมาโตกราฟี การแยกของลิโมนอยด์ - กลูโคไซด์ โดยมีรายงานว่า แฟลชแยก ( ราแมน , โชbrodbelt &ปาติล , 2005 ) , แต่ไม่ใช่สำหรับการแยกของลิโมนอยด์ aglycones จากกลูโคไซด์ . BIOTAGE - การปรับคอลัมน์และต่อเนื่องกับทางเลือกของแอลกอฮอล์และ H2O เป็น inex - หม่นและ toxicologically ใจดีตัวทำละลาย การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาอัตราส่วนของตัวทำละลายสำหรับความละเอียดที่เหมาะสมของลิโมนีน กลูโคไซด์ ( 1 ) และลิโมนิน ( 2 ) เราพบว่าในกลุ่ม 15 % ,2 ให้ครบ และมีการสะสมปริมาณแอลกอฮอล์ ( 20 – 50% ) 2 ตัวอย่าง ด้วยการเพิ่มประสิทธิภาพเป็นตัดสินโดยลดเวลาการเก็บรักษาและความกว้างสูงสุดดังนั้นสังเกตเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าต้องการแยกตั้งได้ด้วยขั้นตอนที่ง่าย ๆไล่ระดับที่ 1 คือ กลุ่มตัวอย่างร้อยละ 15 และ 2 และตัวอย่างด้วยแอลกอฮอล์ 50% และให้พิจารณากันว่า แฟลชกล้อง - - คอลัมน์ ได้เตรียมความพร้อมและมาตราส่วนที่ใช้และแบบที่มีเพียงสองก่อนผสมตัวทำละลายเป็นง่าย ประสบความสำเร็จในอุตสาหกรรมขนาดกว่าการไล่ระดับสีที่ต้องการ โดยวิธี
ในต่อเนื่องกับกลยุทธ์เพื่อแก้ไขโดยสาร 1 และ 2 - Flash Chromatography , เราไปจากมก. เพื่อดังนั้น - กรัม ความจุในการประมวลผลที่เราก้าวหน้าจาก 12 M 75 ลิตร Col - อืมขนาด ตามที่อธิบายในส่วนที่ 2 ปรับสภาพได้ริเริ่มใช้คอลัมน์ของผู้ผลิตแนะนำให้ปรับ - ทอร์ส FAC ,แต่ในที่สุดประสิทธิภาพตาม observa - ใช้งานเชิงประจักษ์และความปรารถนาที่จะลดการเอาชนะตัวทำละลายและกระบวนการและเวลาโดยไม่ resolu - tion . การสรุปเงื่อนไขสำหรับแต่ละระดับที่แสดงในตารางที่ 1 และโครมาตัวอย่างจาก 75 ลิตร วิ่ง การสรุปเงื่อนไขที่แสดงในรูปที่ 2 .
โดยโครมาแสดงบันทึกวิ่งครั้งและละเว้นครั้งลงเพิ่มตัวทำละลายในถังละลาย หรือเอาอยู่ - ตัวอย่างไอเอ็นจีโซลูชั่นจากหลังจากขั้นตอนที่ 2 โดยโครมาแสดงสามยอด พื้นฐานขึ้นเป็นข้อสังเกตก่อนลิตรแรก ( คอลัมน์หนึ่งปริมาตรตัวอย่างที่แคลิฟอร์เนีย 18min และคอลเลกชันของ