data evaluation were performed as d

data evaluation were performed as described above in Example
10. To determine the แอฟฟินิตี้, four dilutions of said มิวทีน were prepared in HBS-EP+ buffer and applied to the chip surface, using concentrations of 128, 32, 8 and 2 nM, respectively.


[00202] The resulting fit curves for SEQ ID NO: 20 are shown in Figure 6. The data show that SEQ ID NO: 20 bound with high แอฟฟินิตี้ to ฮิวเมน PCSK9 (รูป 6A) and to ไซโนมอลกัส มังกี้ PCSK9 (รูป 6B). แอฟฟินิตี้ to mouse PCSK9 (รูป 6C) is lower. Association rate constants k, หรือ kon, dissociation rate constants kd หรือ koff and resulting dissociation constants Kb are summarized in Table6 below.
[00203] Table 6:

+++
[00204] Example 12: Binding of additional ไลโปคาลิน มิวทีน to PCSK9 in solution


[00205] Binding of ไลโปคาลิน มิวทีน and PEGylated รูปแปรผัน thereof (here, with branched PEG40), to biotinylated ฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9-Bio) in solution was tested in vitro using a competition electrochemiluminescence (ECL) assay format (Figure 7). In this experiment, a constant concentration of hPCSK9-Bio was incubated for 1 h with variable concentrations ofไลโปคาลิน มิวทีน SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 22 as well as the PEGylated รูปแปรผัน SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32. After this pre-incubation in solution, an aliquot of the ไลโปคาลิน มิวทีน/PCSK9 ของผสม was transferred to an ECL plate coated with a monoclonal benchmark antibody (ซึ่งประกอบรวมด้วย the light chain of SEQ ID NO: 29 and the heavy chain of SEQ ID NO: 33) to measure the concentration ofhPCSK9 that was not blocked by the ไลโปคาลิน มิวทีน (PEGylated as well as non-PEGylated forms) and therefore could still be bound by the antibody (Figure 7). Competitive mode of action for those ไลโปคาลิน มิวทีน was shown with hPCSK9-Bio.

[00206] All incubation steps were performed with shaking at 300 rpm, and the plate was washed after each incubation step with 80 µl PBS-T buffer (PBS, 0.05% Tween 20) for five times using a Biotek ELx405 select CW washer. In the first step, a 384-well MSD plate was coated with 20 µl of the benchmark antibody at a concentration of 5 µg/ml in PBS over night at 4°C. After washing, the LDL-R-coated wells were blocked with 60 µl PBS-T/BSA (2% BSA in PBS containing 0.05% Tween 20) for 1 h at room temperature.

[00207] A fixed concentration of 10 pM hPCSK9-Bio was incubated in solution with varying concentrations of said มิวทีน, using a starting concentration of 100 nM which was serially diluted at a 1 :3 ratio down to 1. 7 pM in PBS-T/BSA buffer. After 1 h of incubation at
room temperature, 20 µl of the reaction ของผสม were transferred to the antibody-coated ELISA plate to capture unbound (free) PCSK9 for 20 min at room temperature. To allow for transformation of ELISA readout results into free hPCSK9 concentrations (cf. detection and quantification of bound hPCSK9-Bio below), a standard curve containing varying concentrations of hPCSK9-Bio starting with 10 nM (1:3 serially diluted in 11 steps) was prepared in PBS-T/BSA and incubated for 20 min on a MSD plate (MesoScaleDiscovery).

[00208] To allow for detection and quantification of bound hPCSK9-Bio, the residual ส่วนลอย were discarded and 20 µI Sulfo-Tag-labeled สเตรปทาวิดิน (Meso Scale Discovery) was added at a concentration of 1 µg/ml in PBS-T/BSA and incubated for 1 h at room temperature. After washing, 35 µl 2x MSD read buffer with surfactant (Meso Scale Discovery) was added to each well and electrochemiluminescence (ECL) signals were measured within 15 min using the SECTOR Im.ager2400 (Meso Scale Discovery).

[00209] The evaluation was performed as follows: free PCSK9 concentration c(PCSK9)rree was calculated from ECL signals using the standard curve determined in parallel and plotted versus ไลโปคาลิน มิวทีน concentration, c(ไลโปคาลิน มิวทีน). To obtain the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration at which การประกอบขึ้น of the PCSK9/benchmark antibody complex was blocked by 50% (IC50), the curves were fitted by nonlinear regression with a single-ตำแหน่ง binding แบบจำลอง according to c(PCSK9)rree =c(PCSK9)101/(1 +c(ไลโปคาลิน มิวทีน)/IC50)), with the total tracer concentration c(PCSK9)tot and the IC50 value as free parameters. Curve fitting was performed using GraphPad Prism 4 software.

[00210] In summary, ไลโปคาลิน มิวทีน SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22 as well as the PEGylated รูปแปรผัน SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO:
32 showed strong competitive binding to hPCSK9-Bio, when competed against the benchmark antibody (ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NO: 29 and 33). The fitted IC50 values are summarized in Table 7 below.

[00211] Table 7:

+++
[00212] Example13: Inhibitionof PCSK9-mediated downregulation of LDL-R by additional ไลโปคาลิน มิวทีน

[00213] ฮิวเมน PCSK9 induces LDL-R การนำเข้าภายใน and therefore the depletion of LDL-R from the cell surface. Expression of LDL-R was assessed in this assay in presence of ไลโปคาลิน มิวทีน referred in Example 12 (PEGylated (here, with branched PEG40) as well as non-PEGylated forms) to determine the ไลโปคาลิน มิวทีน’ potency to inhibit PCSK9’s activity in mediating LDL-R cell surface depletion, while SEQ ID NO: 2 was used as a negative control.

[00214] HEPG2 cells (10,000 cells/wells) were allowed to attach 24 h in 384-well MSD (Mesoscale Discovery) plate pre-coated with 100 µg/ml poly-d-lysine. Full medium (DMEM containing 1 mg/ml G418 and 10% PBS) was then switched to either DMEM lacking serum หรือ containing 10% lipoprotein-deficient serum to allow maximal expression of LDL-R on the cell surface. Cells were then washed with PBS and dilution series of ไลโปคาลิน มิวทีน in the presence of 100 nM PCSK9 were incubated at 3 7°C for 6 h. The ของผสม was then discarded by gently tapping out and fixation of the cells was then performed by addition of Roti®-Histofix at room temperature for 20 min. Cells were washed twice with PBS and incubated overnight at 4°C with blocking buffer (PBS/PCS 4% I BSA 2%). Buffer was gently discarded and a mix of 1 µg/ml of a goat anti-hLDL-R (R&D systems, Cat. No. AF2148) and
2 µg/ml of a donkey anti-goat-Sulfotag (MSD, Cat. No. R32AG-1) in blocking buffer was incubated at room temperature for 1 h. Cells were then gently twice washed with PBS and Surfactant free reading buffer (MSD) was added. ECL signals were measured using the SECTOR Im.ager 2400 (MSD). The evaluation was performed as follows: ECL signals were transformed by setting the signals measured for PCSK9 activity in the absence of competitor (here, ไลโปคาลิน มิวทีน) to 100% PCSK9 activity. Data were fitted with a sigmoidal dose• response แบบจำลอง with shared slope using GraphPad Prism 4 software (Figure 8). Resulting IC50 and IC90 values are summarized in Table 8 below.

[00215] Table8:

+++
[00216] Example 14: Generation of thermo-stabilized PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน by positional saturationการก่อกลายพันธุ์

[00217] For improvement of thermal stability of PCSK9-specific มิวทีน, ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 13 was mutated at positions 79 and 105 (as shown in Figure 14). ไลบรารี of thermo-stabilized derivatives of SEQ ID NO: l 3were generated in a manner that led to saturated randomization of the mentioned positions either on their own หรือ in combination with the use of recursive assembly of NNK โอลิโกนินิs in a polymerase chain reaction (see, for example, W02007/107563). For the same purpose, ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 22 was mutated at position 92 from Histidine to Proline (as shown in Figure
14).


[00218] Example 15: Identification of thermo-stabilized PCSK9-specific มิวทีน by screening

[00219] The mutagenized central cassette of the ไลบรารี preparation obtained after PCR assembly, as described in Example 14, was inserted into a เวกเตอร์ which allowed bacterial production of the ไลโปคาลิน มิวทีน under the control of a etracycline โปรโมเตอร์ (as described Example 5).

[00220] For แอฟฟินิตี้ ranking of the optimized ไลโปคาลิน มิวทีน, anti-Strep-tag antibody (IBA, Goettingen) diluted in PBS was coated on ไมโครเพลต and 20 µl of BSA-blocked สิ่งเพาะเลี้ยง were added, which allowed specific capture of ไลโปคาลิน มิวทีน on the plate. Different concentrations (0.5 - 5 nM) of biotinylated PCSK9 proteins were added and specifically-bound PCSK9 proteins were detected with extravidin-HRP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) after extensive washing. For quantification, 20 µl QuantaBlu was added and measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 430 nm.

[00221] Selection of thermo-stabilized ไลโปคาลิน มิวทีน was performed in the same way as described above with the only difference that bacterial extracts containing ไลโปคาลิน มิวทีน were heated up to 65°C for 30 min prior to incubation with the PCSK9 target. Those มิวทีน that showed unaffected binding signals after heating step compared to the non-heated samples were selected for sequencing.
[00222] Example 16: Measurement of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดำเนินการประเมินข้อมูลที่อธิบายในตัวอย่างข้างต้น10. การกำหนดแอฟฟินิตี้ dilutions สี่ของมิวทีนกล่าวว่าได้เตรียมใน HBS-EP + บัฟเฟอร์ และใช้พื้นผิว ชิใช้ความเข้มข้นของ 128, 32, 8 และ 2 nM ตามลำดับ[00202] งบโค้งเหมาะสำหรับลำดับ ID ไม่: 20 จะแสดงในรูปที่ 6 ข้อมูลแสดงว่าเลขลำดับ ID: 20 ผูกกับสูงแอฟฟินิตี้ฮิวเมน PCSK9 (รูปที่ 6A) และไซโนมอลกัสมังกี้ PCSK9 (รูปที่ 6B) แอฟฟินิตี้กับเมาส์ PCSK9 (รูป 6C) อยู่ต่ำกว่า ความสัมพันธ์อัตราค่าคงที่ k หรือคอน dissociation อัตราคงบีบหรือ koff และ dissociation ผลลัพธ์คง Kb ได้สรุปไว้ใน Table6 ด้านล่าง [00203] ตาราง 6:+++ตัวอย่าง [00204] 12: มัดมิวทีนไลโปคาลินเพิ่มเติมเพื่อ PCSK9 ในโซลูชันผูก [00205] ไลโปคาลินมิวทีนและ PEGylated รูปแปรผันดังกล่าว (ที่นี่ มี branched PEG40), การ biotinylated ฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9 Bio) ในโซลูชันที่ได้รับการทดสอบในเครื่องที่ใช้แข่งขัน electrochemiluminescence (ECL) วิเคราะห์รูปแบบ (รูปที่ 7) ในการทดลองนี้ ความเข้มข้นคงที่ของไบโอ hPCSK9 เป็น incubated สำหรับ h 1 กับตัวแปรความเข้มข้น ofไลโปคาลิน มิวทีนลำดับ ID ไม่: 13 ลำดับ ID ไม่: 20 และเลขรหัสลำดับ: 22 เป็น PEGylated รูปแปรผันลำดับ ID ไม่: 30 ไม่มีรหัสลำดับ: 31 และเลขรหัสลำดับ: 32 หลังจากฟักตัวนี้ก่อนในการแก้ไขปัญหา เป็นส่วนลงตัวของของผสม มิวทีน/PCSK9 ไลโปคาลินถูกถ่ายโอนไปจาน ECL ที่เคลือบ ด้วยแอนติบอดีโมโนมาตรฐาน (ซึ่งประกอบรวมด้วยสายไฟของลำดับ ID ไม่: 29 และโซ่หนักของลำดับ ID ไม่: 33) วัด ofhPCSK9 ความเข้มข้นที่ไม่ถูกบล็อก โดยไลโปคาลินมิวทีน (PEGylated และฟอร์มไม่ PEGylated) และดังนั้น อาจยังสามารถผูก โดยแอนติบอดี (รูปที่ 7) วิธีดำเนินการสำหรับมิวทีนไลโปคาลินผู้แข่งขันที่แสดงกับไบโอ hPCSK9[00206] ดำเนินทุกขั้นตอนการบ่ม ด้วยการสั่นที่ 300 rpm และมีล้างจานหลังจากแต่ละขั้นตอนบ่มด้วยบัฟเฟอร์ µl PBS T 80 (PBS, 0.05% Tween 20) สำหรับครั้งที่ 5 โดยใช้เครื่อง Biotek ELx405 เลือกตามน้ำหนักจริงซักผ้า ในขั้นแรก จานมือ 384-ดีถูกเคลือบ ด้วย 20 µl ของแอนติบอดี benchmark ที่เข้มข้นของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5 ml ใน PBS ผ่านคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้า บล็อกบ่อ LDL-R-เคลือบ ด้วย 60 µl PBS-T/บี เอสเอ (บีเอสเอ 2% ใน PBS ประกอบด้วย 0.05% Tween 20) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องความเข้มข้นของ A คง [00207] ของ 10 pM hPCSK9 ชีวภาพถูก incubated ในโซลูชันที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของมิวทีนกล่าวว่า การใช้ความเข้มข้นเริ่มต้น 100 nM ซึ่งถูกทำให้เจือจางในอัตรา 1:3 ลงไป 1 serially น. 7 ในบัฟเฟอร์ PBS-T/บี เอสเอ หลังจาก h 1 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ที่ อุณหภูมิห้อง 20 µl ของของผสมปฏิกิริยาถูกโอนย้ายไปที่จาน ELISA เคลือบแอนติบอดีไปจับ PCSK9 ผูก (ฟรี) สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อให้การเปลี่ยนแปลงของผลลัพธ์ readout ELISA เป็นฟรี hPCSK9 ความเข้มข้น (cf. ตรวจจับและนับผูก hPCSK9-ชีวภาพด้านล่าง), เส้นโค้งมาตรฐานที่ประกอบด้วยความเข้มข้นแตกต่างกันของ hPCSK9-ไบโอเริ่มต้น ด้วย 10 nM (1:3 serially diluted ในขั้นตอนที่ 11) ถูกเตรียมใน PBS-T/บี เอสเอ และ incubated สำหรับ 20 นาทีบนจานมือ (MesoScaleDiscovery)[00208] เพื่ออนุญาตการตรวจนับของ hPCSK9 ผูกชีวภาพ ส่วนลอยส่วนที่เหลือถูกยกเลิก และเพิ่มที่ความเข้มข้นของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 1 ml ใน PBS-T/บี เอสเอ และ incubated สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง 20 µI Sulfo-ป้ายป้ายสเตรปทาวิดิน (ค้นพบมาตราส่วนเมโสหน้า) หลังจากซักผ้า 35 µl 2 x มืออ่านบัฟเฟอร์มี surfactant (ค้นพบมาตราส่วนเมโสหน้า) ถูกเพิ่มในแต่ละบ่อและ electrochemiluminescence (ECL) มีวัดสัญญาณภายใน 15 นาทีโดยใช้ Im.ager2400 ภาค (ค้นพบมาตราส่วนเมโสหน้า)[00209] ดำเนินการประเมินเป็นดังนี้: ECL คำนวณความเข้มข้น c (PCSK9) rree PCSK9 ฟรีสัญญาณโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานกำหนดขนาน และพล็อตเทียบกับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้น c (ไลโปคาลินมิวทีน) เพื่อให้ได้ความเข้มข้นมิวทีนไลโปคาลินที่การประกอบขึ้นที่ของ PCSK9/เกณฑ์ มาตรฐานแอนติบอดีซับซ้อนถูกบล็อก โดย 50% (IC50), เส้นโค้งถูกติดตั้ง โดยถดถอยไม่เชิงเส้นกับการแบบจำลองรวมตำแหน่งเดียวตาม rree c (PCSK9) = c (PCSK9) 101 / (1 + c(ไลโปคาลิน มิวทีน)/IC50)), รวมติดตามความเข้มข้น c (PCSK9) ทีโอทีและค่า IC50 เป็นพารามิเตอร์ฟรี เส้นโค้งกระชับที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม 4[00210] ในสรุป ไลโปคาลินมิวทีนลำดับรหัสไม่: 13 ลำดับ ID ไม่: 20 และเลขรหัสลำดับ: 22 เป็น PEGylated รูปแปรผันลำดับ ID ไม่: 30 ลำดับ ID ไม่: 31 และเลขรหัสลำดับ:32 แสดงผูกแข็งแรงแข่งขันกับ hPCSK9-ไบโอ เมื่อร่วมกับแอนติบอดีเกณฑ์มาตรฐานแข่งขัน (ซึ่งประกอบรวมด้วยลำดับรหัส NO: 29 และ 33) ค่า IC50 ผ่อนได้สรุปไว้ในตาราง 7 ด้านล่าง[00211] ตาราง 7:+++ [00212] Example13: downregulation Inhibitionof PCSK9 mediated ของ LDL-R โดยมิวทีนไลโปคาลินเพิ่มเติมฮิวเมน [00213] PCSK9 การนำเข้าภายใน LDL R และลดลงของ LDL-R จากเซลล์พื้นผิวที่แท้จริง ค่าของ LDL-R ถูกประเมินในการทดสอบนี้ในสถานะของมิวทีนไลโปคาลิน 12 ตัวอย่างการอ้างอิง (PEGylated (นี่ กับ branched PEG40) และฟอร์มไม่ PEGylated) กำหนดไลโปคาลินมิวทีน' รู้จักยับยั้งกิจกรรมของ PCSK9 ในการเป็นสื่อกลาง LDL-R เซลล์ผิวจนหมด ในขณะที่ไม่มีรหัสลำดับ: 2 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบเซลล์ HEPG2 [00214] (10000 เซลล์/บ่อ) ได้รับอนุญาตให้แนบ 24 h ในมือ 384-ดี (Mesoscale ค้นพบ) จานก่อนเคลือบ ด้วย 100 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml โพลีดีแอล-ไลซีน เต็มกลาง (DMEM ประกอบด้วย 1 mg/ml PBS G418 และ 10%) แล้วสลับไป DMEM ใดขาดหรือเซรั่มที่ประกอบด้วยซีรั่มไม่ไลโพโปรตีน 10% ให้ค่าสูงสุดของ LDL-R บนผิวเซลล์ เซลล์ได้แล้วล้าง ด้วย PBS และเจือจางชุดของมิวทีนไลโปคาลินในต่อหน้าของ 100 nM PCSK9 ได้ incubated ที่ 3 7 ° C สำหรับ 6 h ของผสมถูกละทิ้ง โดยการเคาะเบา ๆ ออกแล้ว และปฏิกิริยาการตรึงเซลล์แล้วทำ โดยเพิ่ม Histofix ®โรตีที่อุณหภูมิห้อง 20 นาทีเซลล์ถูกล้าง ด้วย PBS สอง และ incubated ค้างคืนที่ 4° C มีบัฟเฟอร์บล็อก (PBS/ซอง 4% ผมบีเอสเอ 2%) ค่อย ๆ ถูกละทิ้งบัฟเฟอร์ และผสมไมโครกรัมเป็นเครื่อง 1 ml ของเป็นแพะต่อต้าน-hLDL-R (R & D ระบบ แมว 555 AF2148) และไมโครกรัมเป็นเครื่อง 2 ml ของการลาต่อต้าน-goat-Sulfotag (มือ แมว ไม่ใช่ R32AG-1) ในบล็อกบัฟเฟอร์ถูก incubated ที่อุณหภูมิห้อง 1 h. เซลล์ได้แล้วสองเบา ๆ ล้าง ด้วย PBS และเพิ่ม Surfactant ฟรีอ่านบัฟเฟอร์ (เครื่องมือ) ECL สัญญาณถูกวัดโดยใช้ Im.ager ภาค 2400 (เครื่องมือ) ดำเนินการประเมินเป็นดังนี้: ECL สัญญาณถูกแปลงค่าสัญญาณที่วัด PCSK9 กิจกรรมของคู่แข่ง (ที่นี่ ไลโปคาลินมิวทีน) กิจกรรม 100% PCSK9 ข้อมูลถูกติดตั้ง ด้วยแบบจำลองคำตอบ sigmoidal dose• กับลาดที่ใช้ร่วมกันโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม 4 (8 รูป) ค่า IC50 ผลลัพธ์และ IC90 ได้สรุปไว้ในตาราง 8 ด้านล่าง[00215] Table8:+++ ตัวอย่าง [00216] 14: รุ่นเทอร์โมเสถียรเฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีนโดย saturationการก่อกลายพันธุ์ ตำแหน่ง[00217] ปรับปรุงเสถียรภาพความร้อนของเฉพาะ PCSK9 มิวทีน มิวทีนไลโปคาลินของลำดับรหัส NO: 13 ได้กลายที่ตำแหน่ง 79 และ 105 (ดังแสดงในรูปที่ 14) ไลบรารีเสถียรเทอร์โมอนุพันธ์ของลำดับ ID ไม่: 3were l ที่สร้างขึ้นในลักษณะที่นำไปสู่การ randomization อิ่มตัวของการกล่าวถึงตำแหน่งบนของตนเองหรือร่วมกับการใช้แอสเซมบลีซ้ำของ โอลิโกนินิs NNK ในปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (ดู เช่น W02007/107563) เพื่อวัตถุประสงค์เดียวกัน มิวทีนไลโปคาลินของเลขลำดับ ID: 22 ได้กลายที่ตำแหน่ง 92 จาก Histidine Proline (ดังแสดงในรูป14)15 ตัวอย่าง [00218]: รหัสของเทอร์โมเสถียรมิวทีน PCSK9 เฉพาะโดยการตรวจคัดกรอง[00219] เทปเซ็นทรัล mutagenized เตรียมไลบรารีที่ได้รับจากแอสเซมบลี PCR ตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่าง 14 ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ซึ่งสามารถผลิตเชื้อแบคทีเรียมิวทีนไลโปคาลินภายใต้การควบคุมของ etracycline โปรโมเตอร์ (เป็นการอธิบายตัวอย่าง 5)[00220] สำหรับแอฟฟินิตี้การจัดอันดับของมิวทีนไลโปคาลินเพิ่มประสิทธิภาพ ป้องกัน-Strep-แท็กแอนติบอดี (อิบา Goettingen) ยกเว้นใน PBS ถูกเคลือบบนไมโครเพลต และ 20 µl ของบีเอสเอบล็อคสิ่งเพาะเลี้ยง เพิ่ม ซึ่งได้จับภาพเฉพาะของไลโปคาลินมิวทีนในจาน ความเข้มข้นแตกต่างกัน (0.5 - 5 nM) ของ biotinylated PCSK9 เพิ่มโปรตีน และโปรตีนโดยเฉพาะผูก PCSK9 พบกับ extravidin-HRP (Aldrich ซิก St. Louis, MO) หลังจากซักผ้าอย่างละเอียด นับ 20 µl QuantaBlu ถูกเพิ่ม และวัดที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 430 nmมิวทีนไลโปคาลินเทอร์โมเสถียร [00221] เลือกที่ดำเนินการในลักษณะเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้นมีความแตกต่างเพียงว่า สารสกัดจากแบคทีเรียที่ประกอบด้วยไลโปคาลินมิวทีนมีความร้อนถึง 65° C สำหรับ 30 นาทีก่อนบ่มกับเป้าหมาย PCSK9 มิวทีนเหล่านั้นแสดงให้เห็นสัญญาณรวมผลกระทบจากความร้อนขั้นตอนเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ได้ออกกำลังกายถูกเลือกสำหรับการจัดลำดับ ตัวอย่าง [00222] 16: วัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การประเมินผลข้อมูลที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในตัวอย่างที่
10 เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้สี่เจือจางกล่าวว่ามิวทีนได้จัดทำขึ้น HBS-EP + กันชนและนำไปใช้กับพื้นผิวของชิปที่ใช้ความเข้มข้น 128, 32, 8 และ 2 นาโนเมตรตามลำดับ. [00202] ผล เส้นโค้งที่เหมาะสำหรับ SEQ ID NO: 20 จะแสดงในรูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าข้อมูล SEQ ID NO: 20 มัดด้วยสูงแอฟฟินิตี้ที่จะฮิวเมน PCSK9 (รูป 6A) และไซโนมอลกัสมัง PCSK9 กี้ (รูป 6B) แอฟฟินิตี้ที่จะ PCSK9 เมาส์ (รูป 6C) จะต่ำกว่า ค่าคงที่อัตราสมาคม k, กรณ์หรือค่าคงที่อัตราการแยกตัวออก KD หรือ Koff และแยกออกจากกันส่งผลให้คงที่ Kb ได้สรุปไว้ใน Table6 ด้านล่าง. [00203] ตารางที่ 6: +++ [00,204] ตัวอย่าง 12: ผูกเพิ่มเติมของไลโปคาลินมิว ทีนที่จะ PCSK9 ในการแก้ปัญหา[00205] ผูกพันของไลโปคาลินมิวทีนและ PEGylated รูปแปรผันดังกล่าว (ที่นี่มี PEG40 แยก) เพื่อไบโอตินฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9 ไบโอ) ในการแก้ปัญหาได้รับการทดสอบในหลอดทดลอง ใช้ electrochemiluminescence การแข่งขัน (ECL) รูปแบบการทดสอบ (รูปที่ 7) ในการทดลองนี้มีความเข้มข้นอย่างต่อเนื่องของ hPCSK9 ไบโอถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงมีความเข้มข้นของตัวแปรไลโปคาลินมิวทีน SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 20 และ SEQ ID NO: 22 เช่นเดียวกับ PEGylated รูปแปรผัน SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32. หลังจากนี้ก่อนการบ่มในการแก้ปัญหาการหารของไลโปคาลินมิวทีน / PCSK9 ของผสมที่ถูกย้ายไป แผ่น ECL เคลือบด้วยแอนติบอดีมาตรฐานโมโนโคลนอล (ซึ่งประกอบรวมด้วยห่วงโซ่แสงของ SEQ ID NO: 29 และห่วงโซ่หนักของ SEQ ID NO: 33) การวัด ofhPCSK9 ความเข้มข้นที่ไม่ได้ถูกปิดกั้นโดยไลโปคาลิน มิวทีน (PEGylated เช่นเดียวกับรูปแบบที่ไม่ PEGylated) และดังนั้นจึงยังคงสามารถที่จะผูกพันตามแอนติบอดี (รูปที่ 7) โหมดการแข่งขันของการดำเนินการสำหรับผู้ไลโปคาลินมิวทีนก็แสดงให้เห็นกับ hPCSK9 ไบโอ. [00206] ขั้นตอนการบ่มทั้งหมดถูกดำเนินการด้วยการเขย่าที่ 300 รอบต่อนาทีและจานถูกล้างหลังจากที่แต่ละขั้นตอนการบ่ม 80 ไมโครลิตร PBS- บัฟเฟอร์ T (พีบีเอส, 0.05% Tween 20) ห้าครั้งใช้ Biotek ELx405 เลือกเครื่องซักผ้า CW ในขั้นตอนแรกเป็น 384 แผ่นดีเอ็มเอสได้รับการเคลือบด้วย 20 ไมโครลิตรของแอนติบอดีมาตรฐานที่ความเข้มข้น 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอสในช่วงคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากล้างที่ LDL-R-เคลือบหลุมถูกบล็อก 60 ไมโครลิตรพีบีเอส-T / บีเอสเอ (2% บีเอสเอพีบีเอสที่มีใน Tween 0.05 20%) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง. [00207] ความเข้มข้นคงที่ 10:00 hPCSK9- ไบโอถูกบ่มในการแก้ปัญหาที่มีความเข้มข้นที่แตกต่างของมิวกล่าวว่าทีนโดยใช้ความเข้มข้นเริ่มต้น 100 นาโนเมตรซึ่งได้รับการปรับลดลำดับที่ 1: 3 อัตราส่วนลงไป 1 07:00 พีบีเอสใน-T / บัฟเฟอร์บีเอสเอ หลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่มที่อุณหภูมิห้อง20 ไมโครลิตรของปฏิกิริยาของผสมมีการถ่ายโอนไปยังจาน ELISA แอนติบอดีเคลือบในการจับภาพหลุด (ฟรี) PCSK9 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อให้การเปลี่ยนแปลงของผลการอ่านข้อมูลวิธี ELISA เข้าสู่ความเข้มข้น hPCSK9 ฟรี (cf เลยการตรวจสอบและการหาปริมาณของที่ถูกผูกไว้ hPCSK9 ไบโอด้านล่าง) เส้นโค้งที่มีมาตรฐานความเข้มข้นที่แตกต่างของ hPCSK9 ไบโอเริ่มต้นด้วย 10 นาโนเมตร (1: 3 ปรับลดลำดับในขั้นตอนที่ 11) ถูกจัดทำขึ้นในพีบีเอส-T / บีเอสเอและบ่มเป็นเวลา 20 นาทีบนแผ่นเอ็มเอส (MesoScaleDiscovery). [00208] เพื่ออนุญาตให้มีการตรวจสอบและปริมาณที่ถูกผูกไว้ hPCSK9 ไบโอที่ส่วนที่เหลือลอยถูกโยนทิ้งและ 20 μI Sulfo-แท็กติดฉลาก สเตรปทาวิดิน (Meso ขนาดค้นพบ) ถูกบันทึกที่ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส-T / บีเอสเอและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้าง 35 ไมโครลิตร 2x เอ็มเอสอ่านบัฟเฟอร์ที่มีแรงตึงผิว (Meso ขนาดค้นพบ) ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดีและ electrochemiluminescence (ECL) สัญญาณวัดภายใน 15 นาทีโดยใช้ภาค Im.ager2400 (Meso ขนาดค้นพบ). [00209] การประเมินผลเป็น ดำเนินการดังต่อไปนี้ความเข้มข้น PCSK9 ฟรีค (PCSK9) rree ที่คำนวณได้จากสัญญาณ ECL ใช้กราฟมาตรฐานที่กำหนดไว้ในแบบขนานและพล็อตเมื่อเทียบกับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นค (ไลโปคาลินมิวทีน) . การขอรับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นที่การประกอบขึ้นของ PCSK9 / ซับซ้อนแอนติบอดีมาตรฐานถูกบล็อกโดย 50% (IC50) เส้นโค้งพอดีโดยการถดถอยเชิงเส้นเดียวกับตำแหน่งที่มีผลผูกพันตามแบบจำลอง ค (PCSK9) rree = c (PCSK9) 101 / (1 ​​+ C (ไลโปคาลินมิวทีน) / IC50)) ที่มีความเข้มข้นครอยรวม (PCSK9) ทีโอทีและค่า IC50 เป็นพารามิเตอร์ฟรี . ปรับเส้นโค้งได้รับการดำเนินการโดยใช้ปริซึม GraphPad 4 ซอฟแวร์. [00210] โดยสรุปไลโปคาลินมิวทีน SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 22 เช่นเดียวกับ PEGylated รูปแปรผัน SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 ID SEQ NO: 32 แสดงให้เห็นความแข็งแกร่งในการแข่งขันที่จะมีผลผูกพัน hPCSK9 ไบโอเมื่อแข่งขันกับแอนติบอดีมาตรฐาน (ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NO: 29 และ 33) ค่า IC50 ติดตั้งได้สรุปไว้ในตารางที่ 7 ด้านล่าง. [00211] ตารางที่ 7: +++ [00,212] Example13: Inhibitionof PCSK9 พึ่ง downregulation ของ LDL-R โดยเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีน[00213] ฮิว เมน PCSK9 ก่อให้เกิดการลดระดับ LDL-R การนำเข้าภายในและดังนั้นจึงลดลงของระดับ LDL-R จากเซลล์ผิว การแสดงออกของ LDL-R ได้รับการประเมินในการทดสอบในการปรากฏตัวของไลโปคาลินมิวทีนเรียกว่าในตัวอย่างที่ 12 (PEGylated (ที่นี่มี PEG40 แยก) เช่นเดียวกับรูปแบบที่ไม่ PEGylated) เพื่อตรวจสอบไลโปคาลิ นมิวทีน 'ความแรงในการยับยั้งกิจกรรม PCSK9 ใน mediating เซลล์ LDL-R สูญเสียพื้นผิวในขณะที่ SEQ ID NO. 2 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ[00214] เซลล์ HepG2 (10,000 เซลล์ / หลุม) ได้รับอนุญาตให้แนบ 24 ชั่วโมง ใน 384 ดีเอ็มเอส (Mesoscale ค้นพบ) แผ่นก่อนเคลือบด้วย 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรโพลี D-ไลซีน กลางเต็ม (DMEM ที่มี 1 mg / ml G418 และพีบีเอส 10%) ก็เปิดแล้วทั้งเซรั่มขาด DMEM หรือเซรั่มที่มีส่วนผสมของไลโปโปรตีนขาด 10% เพื่อให้การแสดงออกสูงสุดของ LDL-R บนผิวเซลล์ เซลล์ที่ถูกล้างแล้วกับพีบีเอสและชุดลดสัดส่วนของไลโปคาลินมิวทีนในที่ที่ 100 นาโนเมตร PCSK9 ที่ถูกบ่มที่ 3 7 ° C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ของผสมทิ้งแล้วโดยการแตะเบา ๆ ออกมาและการตรึงของเซลล์ที่ได้ดำเนินการแล้วโดยนอกเหนือจากRoti®-Histofix ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที เซลล์ที่ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและบ่มค้างคืนที่ 4 ° C ที่มีการปิดกั้นกันชน (พีบีเอส / PCS 4% ผม BSA 2%) บัฟเฟอร์ทิ้งอย่างอ่อนโยนและมีส่วนผสมของ 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรแพะต่อต้าน hLDL-R (R & D ระบบแคท. ฉบับที่ AF2148) และ2 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรลาต่อต้านแพะ Sulfotag (เอ็มเอส, แมว. ฉบับที่ R32AG-1) ในการปิดกั้นกันชนถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกเบา ๆ แล้วล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและลดแรงตึงผิวบัฟเฟอร์อ่านฟรี (เอ็มเอส) ถูกเพิ่มเข้ามา สัญญาณ ECL ถูกวัดโดยใช้ภาค Im.ager 2400 (เอ็มเอส) การประเมินผลการดำเนินการดังต่อไปนี้: สัญญาณ ECL ถูกเปลี่ยนโดยการตั้งค่าสัญญาณที่วัดได้ว่าเป็นกิจกรรมที่ PCSK9 ในกรณีที่ไม่มีคู่แข่ง (ที่นี่, ไลโปคาลินมิวทีน) ถึง 100% กิจกรรม PCSK9 ข้อมูลการติดตั้งที่มีขนาด sigmoidal ตอบสนอง•แบบจำลองมีความลาดชันที่ใช้ร่วมกันโดยใช้ปริซึม GraphPad 4 ซอฟแวร์ (รูปที่ 8) IC50 ส่งผลให้ค่า IC90 และมีรายละเอียดในตารางที่ 8. [00215] Table8: +++ [00,216] ตัวอย่างที่ 14: การสร้างเทอร์โมมีความเสถียร PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีนโดยอิ่มตัวตำแหน่งการก่อกลายพันธุ์[00217] สำหรับการปรับปรุงเสถียรภาพทางความร้อนของ PCSK9 เฉพาะมิวทีน, ไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 13 กลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 79 และ 105 (ดังแสดงในรูปที่ 14) ไลบรารีอนุพันธ์เทอร์โมมีความเสถียรของ SEQ ID NO: ลิตร 3were สร้างขึ้นในลักษณะที่นำไปสู่การสุ่มอิ่มตัวของตำแหน่งดังกล่าวทั้งในหรือของตัวเองในการทำงานร่วมกับการใช้งานในการชุมนุมเรียกซ้ำของ NNK โอลิโกนินิในโพลิเมอร์ที่ ปฏิกิริยาลูกโซ่ (ดูตัวอย่างเช่น W02007 / 107563) เพื่อจุดประสงค์เดียวกันไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 22 กลายพันธุ์ที่ 92 ตำแหน่งจากการ Histidine Proline (ดังแสดงในรูปที่. 14) [00218] ตัวอย่าง 15: บัตรประจำตัวของเทอร์โม PCSK9- มีความเสถียร โดยเฉพาะมิวทีนโดยการคัดกรอง[00219] เทปกลาง mutagenized ของการเตรียมไลบรารีได้รับหลังจากการชุมนุม PCR ตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 14 ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ที่ได้รับอนุญาตการผลิตแบคทีเรียของไลโปคาลินมิวทีน ภายใต้การควบคุมของ etracycline โปรโมเตอร์ (ตามที่อธิบายไว้ตัวอย่าง 5). [00220] สำหรับแอฟฟินิตี้จัดอันดับของการเพิ่มประสิทธิภาพไลโปคาลินมิวทีน, ป้องกัน Strep แท็กแอนติบอดี (IBA, Goettingen) เจือจางใน พีบีเอสได้รับการเคลือบบนไมโครเพลตและ 20 ไมโครลิตรของบีเอสเอถูกบล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงที่ถูกเพิ่มซึ่งได้รับอนุญาตจับภาพเฉพาะของไลโปคาลินมิวทีนบนจาน ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0.5-5 นาโนเมตร) ของไบโอตินโปรตีน PCSK9 ถูกเพิ่มและโดยเฉพาะโปรตีนที่ถูกผูกไว้ PCSK9 ตรวจพบกับ extravidin-HRP (ซิกม่าดิช, เซนต์หลุยส์) หลังจากล้างที่กว้างขวาง สำหรับปริมาณ 20 ไมโครลิตร QuantaBlu ถูกบันทึกและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 430 นาโนเมตร. [00221] การเลือกเทอร์โมมีความเสถียรไลโปคาลินมิวทีนได้ดำเนินการในลักษณะเดียวกันตามที่อธิบายไว้ ดังกล่าวข้างต้นมีความแตกต่างเพียงอย่างเดียวที่มีสารสกัดจากแบคทีเรียไลโปคาลินมิวทีนถูกความร้อนถึง 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะมีการบ่มด้วยเป้าหมาย PCSK9 ผู้ที่มิวทีนที่แสดงให้เห็นสัญญาณได้รับผลกระทบที่มีผลผูกพันหลังจากขั้นตอนที่ความร้อนเมื่อเทียบกับกลุ่มตัวอย่างที่ไม่ได้อุ่นถูกเลือกสำหรับการจัดลำดับ. [00222] ตัวอย่าง 16: การวัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การประเมินข้อมูลมีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในตัวอย่าง
10 หาแอฟฟินิตี้สี่วิธีการพูดมิวทีนเตรียมใน hbs-ep บัฟเฟอร์ และใช้กับพื้นผิวชิปโดยใช้ความเข้มข้นของ 128 , 32 , 8 และ 2 นาโนเมตร


[ 00202 ] ส่งผลให้พอดีกับเส้นโค้งสำหรับ seq id : 20 มีแสดงในรูปที่ 6 ข้อมูลที่แสดงให้เห็นว่าไม่มี seq id :20 ที่ถูกผูกไว้กับแอฟฟินิตี้สูงฮิวเมน pcsk9 ( รูป 6A ) และไซโนมอลกัสมังกี้ pcsk9 ( รูป 6B ) แอฟฟินิตี้เพื่อ pcsk9 เมาส์ ( รูป 6C ) ลดลง สมาคมค่าคงที่ K ค็อคกลการ , ค่าคงที่และค็อค คอฟฟ์ และเป็นผลสรุปในบางครั้งเป็นค่าคงที่การแตกตัว table6 ด้านล่าง
[ 00203 ] ตารางที่ 6 :


[ 00204 ] ตัวอย่าง 12 :( เพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีนเพื่อ pcsk9 ในโซลูชัน


[ 00205 ] การจับและไลโปคาลินมิวทีน pegylated รูปแปรผันของมัน ( ที่นี่มีสาขา peg40 ) , ไลฮิวเมน pcsk9 ( hpcsk9 ไบโอ ) ในสารละลายทดสอบในหลอดทดลองโดยใช้รูปแบบการแข่งขัน electrochemiluminescence ( ECL ) ) ( รูปที่ 7 ) ในการทดลองนี้ปริมาณคงที่ของ hpcsk9 ไบโอถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีน seq id : 13 : 20 หมายเลข seq และ seq ไม่มี ID : 22 รวมทั้ง pegylated รูปแปรผัน seq id : 30 : 31 หมายเลข seq seq id : 32 หลังนี้ก่อนบ่มในสารละลายเป็นส่วนลงตัวของไลโปคาลินมิวทีน / pcsk9 ของผสมถูกย้ายไปยัง ECL แผ่นเคลือบด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีมาตรฐาน ( ซึ่งประกอบรวมด้วยแสงห่วงโซ่ seq id : 29 และห่วงโซ่หนักของ seq id ไม่ :33 ) เพื่อวัดความเข้มข้น ofhpcsk9 ที่ไม่ได้ถูกบล็อกโดยไลโปคาลินมิวทีน ( pegylated รวมทั้งไม่มีรูปแบบ pegylated ) และดังนั้นจึงอาจยังคงถูกผูกมัดโดยแอนติบอดี ( รูปที่ 7 ) โหมดการแข่งขันของการกระทำสำหรับผู้ที่ไลโปคาลินมิวทีนแสดงกับ hpcsk9 ไบโอ

[ 00206 ] ทั้งหมด 4 ขั้นตอนคือการเขย่า ที่ 300 รอบต่อนาที ,และจานถูกล้างหลังจากแต่ละขั้นตอนการบ่ม 80 µผม pbs-t บัฟเฟอร์ ( PBS ) , tween 20 ) 5 ครั้ง โดยใช้ biotek elx405 เลือก CW เครื่องซักผ้า ในขั้นตอนแรก เพราะดีเอ็มเอสจานที่เคลือบด้วยµ 20 ลิตรมาตรฐานแอนติบอดีที่ความเข้มข้น 5 µ g / ml ใน PBS ผ่านคืนที่ 4 องศา หลังจากล้าง , ldl-r-coated บ่อน้ำที่ถูกบล็อก 60 µผม pbs-t / BSA ( BSA 2% ใน PBS ที่มี 005 tween 20 ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง

[ 00207 ] คงความเข้มข้น 10 น. hpcsk9 ไบโอถูกบ่มในสารละลายที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของบอกว่ามิวทีนใช้เริ่มต้น ความเข้มข้น 100 nm ซึ่งเป็นเจือจางในอัตราส่วน 1 : 3 ลง 1 1 ทุ่ม pbs-t / ขนาดบัฟเฟอร์ หลังจาก 1 ชั่วโมงของ
บ่มที่อุณหภูมิห้อง20 µ L ของปฏิกิริยาของผสมถูกโอนไปโดยวิธีเคลือบจานจับหลุด ( ฟรี ) pcsk9 สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การอนุญาตให้เปลี่ยนแปลงวิธีอ่านผลเป็นฟรี hpcsk9 ความเข้มข้น ( CF . การตรวจหาปริมาณของผูกพันและ hpcsk9 ชีวภาพด้านล่าง ) มาตรฐานเส้นโค้งที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ hpcsk9 ไบโอ เริ่มต้นด้วย 10 nm ( 13 เป็นเจือจางในขั้นตอนที่ 11 ) ที่เตรียมไว้ใน pbs-t / BSA บ่มนาน 20 นาทีบนเอ็มเอสจาน ( mesoscalediscovery )

[ 00208 ] เพื่อให้สามารถตรวจจับและปริมาณของ hpcsk9 จำกัดทางชีวภาพการส่วนลอยที่เหลือถูกละทิ้งและ 20 µผม sulfo แท็กป้ายสเตรปทาวิดินค้นพบระดับเมโซ ) เพิ่มความเข้มข้น 1 µ g / ml ใน pbs-t / BSA บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากอาบน้ำเสร็จ35 µชั้น 2x อัตโนมัติอ่านบัฟเฟอร์กับสารลดแรงตึงผิว ( Discovery ) เมโส ) เพิ่มกัน electrochemiluminescence ( ECL ) และสัญญาณที่วัดได้ภายใน 15 นาที โดยใช้ภาค im.ager2400 ค้นพบระดับเมโซ )

[ 00209 ] การประเมินผลการปฏิบัติ ดังนี้ฟรี pcsk9 ความเข้มข้น C ( pcsk9 ) rree คำนวณได้จากการทดสอบโดยใช้สัญญาณกราฟมาตรฐานกำหนดในแบบขนานและวางแผนกับไลโปคาลินมิวทีนความเข้มข้น , C ( ไลโปคาลินมิวทีน ) เพื่อให้ได้ไลโปคาลินมิวทีนความเข้มข้นการประกอบขึ้นซึ่ง pcsk9 / มาตรฐานของแอนติบอดีที่ถูกบล็อกโดย 50% ( ic50 )เส้นโค้งถูกติดตั้งโดยการถดถอยเชิงเส้นกับเดียว - ตำแหน่งผูกแบบจำลองตาม C ( pcsk9 ) rree = C ( pcsk9 ) 101 / 1 C ( ไลโปคาลินมิวทีน ) / ic50 ) ด้วยทั้งหมดติดตามความเข้มข้น C ( pcsk9 ) ทีโอทีและค่า ic50 เป็นพารามิเตอร์อิสระ เส้นโค้งแสดงการใช้ graphpad ปริซึม 4 ซอฟต์แวร์

[ 00210 ] สรุปไลโปคาลินมิวทีน seq id ไม่ :13 : 20 และ seq id ไม่มี seq id : 22 รวมทั้ง pegylated รูปแปรผัน seq id : 30 : 31 หมายเลข seq seq id :
32 พบการแข่งขันที่แข็งแกร่งผูก hpcsk9 ไบโอ ตอนแข่งกับมาตรฐานแอนติบอดี ( ซึ่งประกอบรวมด้วย seq id : 29 และ 33 ) ic50 ติดตั้งค่าในตารางที่ 7 สรุปด้านล่าง

[ 00211 ] ตารางที่ 7 :


[ 00212 ] example13 :inhibitionof pcsk9 ) downregulation ของ ldl-r โดยเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีน

[ ] ฮิวเมน 00213 pcsk9 ก่อให้เกิด ldl-r การนำเข้าภายในและดังนั้นการ ldl-r จากผิวเซลล์ การแสดงออกของ ldl-r และในวิธีนี้ในการแสดงตนของไลโปคาลินมิวทีนเรียกว่าในตัวอย่าง 12 ( pegylated ( ที่นี่