2.6.2. Isolation of peripheral bloo

2.6.2. Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Isolation of peripheral blood mononuclear cells was separated from venous blood of healthy volunteers. Blood was
diluted 1:2 with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2), layered on Histopaque (Sigma, Steinhem, Germany), washed
thrice with PBS and resuspended in complete RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). The cells
were counted and resuspended at a concentration of 1×106 cells/ml in RPMI supplemented with 10% FCS. Cell
viability was determined using the tryphan blue dye exclusion test. Viability of more than 95% was satisfactory.
2.6.3. Quantification of cytokines after treatment with plant extracts
A one-ml culture of PBMC (1×106 cells) was setup in 24-well tissue culture plates (Corning, USA) and stimulated
with heat-killed P. acnes (108 organisms/ml) in the presence or absence of different crude extracts of plants at
concentrations of 5 and 50 μg/ml. Cultures were incubated at 37 °C for 18 h in a humidified atmosphere containing 5%
CO2. Cultures without stimulants were set up as controls. The following day, cultures were transferred to microfuge
tubes and centrifuged to collect cell-free supernatant containing secreted cytokines.
Cell-free supernatants were analyzed for TNF-α by commercially available sandwich ELISA (Biosource, USA).
The ratio (%) of inhibition of the cytokine release was calculated using the following equation:
Degree of inhibitionð%Þ ¼ 100  ð1−T=CÞ
T represents the concentration of cytokines in culture supernatant with the test compound.
C represents the concentration of cytokines in culture supernatant with the solvent.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6.2 การแยกของอุปกรณ์ต่อพ่วงเลือดเซลล์ mononuclear (PBMCs)แยกของเลือดต่อพ่วง mononuclear เซลล์ถูกแยกออกจากเลือดดำของอาสาสมัครสุขภาพดี เลือดได้ผสม 1:2 กับ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS, pH 7.2), ชั้นบน Histopaque (ซิก Steinhem เยอรมนี), เครื่องซักผ้าด้วย PBS และ resuspended ในสมบูรณ์ RPMI-1640 เลยเสริม ด้วยเซรั่มและทารกในครรภ์ลูก 10% (FCS) เซลล์ตรวจนับ และ resuspended ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์/มล.ใน RPMI เสริมกับ FCS 10% เซลล์ชีวิตที่ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบแยกย้อมสีฟ้า tryphan ชีวิตมากกว่า 95% น่าพอใจ2.6.3 การนับของ cytokines หลังจากที่รักษาด้วยสารสกัดจากพืชวัฒนธรรมหนึ่ง ml ของ PBMC (1 × 106 เซลล์) ถูกตั้งค่าในเยื่อดี 24 แผ่น (คอร์นทำ สหรัฐอเมริกา) และถูกกระตุ้นด้วยความร้อนฆ่า P. สิว (108 ชีวิต/ml) ในหรือบางส่วนน้ำมันพืชที่ความเข้มข้นของ μg 5 และ 50 / มลวัฒนธรรมถูก incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 18 ในบรรยากาศ humidified ประกอบด้วย 5%CO2 วัฒนธรรม โดยไม่มีสารกระตุ้นอย่างถูกตั้งค่าเป็นตัวควบคุม วันต่อไปนี้ วัฒนธรรมถูกโอนย้ายไป microfugeท่อ และ centrifuged supernatant ฟรีเซลล์ secreted cytokines ที่ประกอบด้วยการเก็บรวบรวมเซลล์ฟรี supernatants ได้วิเคราะห์ความ TNF-α ด้วยแซนวิชใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ ELISA (Biosource สหรัฐอเมริกา)อัตราส่วน (%) ของการยับยั้งการปล่อยอย่างไร cytokine ถูกคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:ระดับของ inhibitionð %Þ¼ 100 ð1−T = CÞT หมายถึงความเข้มข้นของ cytokines ใน supernatant วัฒนธรรมกับการทดสอบที่ซับซ้อนC แทนความเข้มข้นของ cytokines ในวัฒนธรรม supernatant กับตัวทำละลาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6.2 การแยกเซลล์เลือดโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs)
การแยกตัวของเซลล์ในเลือดโมโนนิวเคลียร์ถูกแยกออกจากเลือดดำของอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี เลือด
เจือจาง 1: 2 ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอสพีเอช 7.2), ชั้นบน Histopaque (Sigma, Steinhem, เยอรมนี) ล้าง
สามครั้งกับพีบีเอสและ resuspended ในสมบูรณ์ RPMI-1640 เสริมด้วย 10% ซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (FCS) . เซลล์
นับและ resuspended ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มลใน RPMI เสริมด้วย 10% FCS เซลล์
มีชีวิตถูกกำหนดโดยใช้สีย้อม tryphan ฟ้าทดสอบการยกเว้น ศักยภาพของมากกว่า 95% เป็นที่น่าพอใจ.
2.6.3 ปริมาณของ cytokines หลังการรักษาด้วยสารสกัดจากพืช
วัฒนธรรมหนึ่งมิลลิลิตร PBMC (1 × 106 เซลล์) เป็นแผ่นติดตั้งในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 24 หลุม (Corning, USA) และการกระตุ้น
ด้วยความร้อนฆ่าสิว P. (108 ชีวิต / ml) ในที่ที่มีหรือไม่มีสารสกัดที่แตกต่างกันของพืชที่
ความเข้มข้น 5 และ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร วัฒนธรรมบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18 ชั่วโมงในบรรยากาศที่มีความชื้น 5%
CO2 วัฒนธรรมโดยไม่ต้องกระตุ้นถูกตั้งขึ้นเป็นตัวควบคุม วันรุ่งวัฒนธรรมถูกถ่ายโอนไป microfuge
หลอดและหมุนเหวี่ยงที่จะเก็บใสปราศจากเซลล์ที่มี cytokines หลั่ง.
supernatants มือถือฟรีมาวิเคราะห์ TNF-αโดยวิธี sandwich ELISA ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (Biosource สหรัฐอเมริกา).
สัดส่วน (%) การยับยั้ง ของการปล่อยไซโตไคน์ที่คำนวณโดยใช้สมการดังต่อไปนี้:
ปริญญาinhibitionð% Þ¼ 100 D1-T = CTH
T แสดงให้เห็นถึงความเข้มข้นของสารละลาย cytokines ในวัฒนธรรมที่มีสารทดสอบ.
ซีแสดงให้เห็นถึงความเข้มข้นของสารละลาย cytokines ในวัฒนธรรมที่มีตัวทำละลาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดาวน์โหลด . การแยกเซลล์เม็ดเลือดขาวปกติ ( PBMCs )
แยกเซลล์เม็ดเลือดขาวปกติแยกจากเลือดจากหลอดเลือดดำของอาสาสมัครสุขภาพดี เลือดถูกเจือจาง 1 : 2 กับเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์
( PBS , pH 7.2 ) ชั้นบน histopaque ( Sigma , steinhem , เยอรมัน ) , ล้างด้วย pbs resuspended
3 ครั้ง และใน rpmi-1640 สมบูรณ์เสริม 10% เซรั่มของลูกวัว ( FCS )เซลล์
ถูกนับและ resuspended ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตรใน RPMI เสริม 10% FCS . เซลล์
ความมีชีวิตตั้งใจใช้ tryphan สีน้ำเงินย้อมไปทดสอบ และกว่า 95% พอใจ
2.6.3 . ปริมาณของสารหลังการรักษาด้วยสารสกัดจากพืช
1 ml วัฒนธรรมพื้นฐาน ( 1 × 106 เซลล์ ) คือการติดตั้งด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใน 24 แผ่น ( ในคอร์นนิงสหรัฐอเมริกา ) และกระตุ้น
กับความร้อนฆ่าหน้า acnes ( 108 ) / ml ) ในการแสดงตนหรือขาดแตกต่างกันสกัดพืช
ความเข้มข้น 5 และ 50 กรัม / มิลลิลิตรμวัฒนธรรมบ่มที่ 37 ° C ) 18 H ในบรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ humidified 5 %

วัฒนธรรมไร้สารกระตุ้นถูกตั้งค่าเป็นตัวควบคุม วันต่อมา ได้มีการโอน microfuge
วัฒนธรรมท่อไฟฟ้า เพื่อรวบรวมนำที่มีการสังเคราะห์หลั่ง cytokines .
เซลล์ supernatants ฟรีวิเคราะห์ TNF - αโดยอาดแซนด์วิช ELISA ( biosource , USA ) .
สัดส่วน ( % ) ในการยับยั้งของไซโตไคน์ปล่อยคำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้ :
: การยับยั้งð % Þ¼ 100  ð− 1 Þ
t = cไม่แสดงถึงความเข้มข้นของ cytokines ในนำวัฒนธรรมกับการทดสอบสาร .
c แสดงถึงความเข้มข้นของ cytokines ในนำวัฒนธรรมกับตัวทำละลาย