3.2. Whole animal preparations (emb

3.2. Whole animal preparations (embryos through to early postlarvae)
In our experience shrimp embryos must be at least 6 h old to provide a clear signal and to determine the ploidy level accurately when using flow cytometry. In general 40–50 embryos is the minimum number that will give reliable results, with aspiration, 3– 4 times through a 27 guage needle pushed against the side of a tube, being a simple way to prepare the cell suspension (aspiration is performed after the addition of a suitable quantity of stain as described below). Shrimp nauplii of any stage give reliable flow cytometry results with a minimum number required being in the range of 10–30 individuals, with cell suspensions prepared in the same manner as the embryos. Similarly, protozoea, mysis and postlarvae of any stage give reliable flow cytometry results; however, this can be performed on individuals if required. Protozoeal cell suspensions can be prepared in the same manner as the embryos whilst mysis and postlarval cell suspensions are easily prepared by physically grinding the individual animal(s) with a sterile pipette tip in a tube prior to addition of the stain. Figure 2 summarises these preparation procedures.
3.3. Non-destructive tissue and haemocyte preparations
Muscle and other tissues from larger shrimp give reliable flow cytometryresultsbysimplephysicalgrindingpriortoadditionofthestain. Shrimp haemocyte samples provide the cleanest DNA source for ploidy determination using flow cytometry and can be taken non-destructively once the shrimp reach a size where a pleopod can be easily removed (i.e. 2–3 g). Shrimp haemocytes should be suspended in an anticoagulant solution (Vargas-Albores et al., 1993) and stain added (i.e. there is no physical shearing of cells required). Prior to the addition of the stain, an optional centrifugationofthesuspensionfor5 minat6,000 gfollowedby removalofthesupernatantcanbeperformedifthenumberofhaemocytes collected is low.
3.4. Internal flow cytometry control
After preparation of shrimp cell suspensions and addition of a suitable quantity of stain, an internal standard control like glutaral- dehyde fixed Chicken Red Blood Cells (CRBC prepared from chicken erythrocytes) (Robinson, 1993) should be included, when running samples through a flow cytometer, to ensure the integrity of experimental results. In locations where such preparations are difficult to make or are not available, chicken blood diluted in marine phosphate buffered solution can be used as an alternative; however, the shelf-life is short (i.e. 4 to 6 h). Another commonly used internal standard control for flow cytometry is Trout Cells (Beckman CoulterTM); however, they are not suitable for use with shrimp ploidy analysis as their DNA content is similar to that of shrimp and the signal peaks overlap and cannot be properly differentiated from those of the shrimp.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2 ทั้งสัตว์เตรียม (โคลนผ่านไป postlarvae ก่อน)ของเรา กุ้งโคลนต้องสามารถให้สัญญาณที่ชัดเจนและ การกำหนดระดับพล็อยดีแม่นยำเมื่อใช้เซลล์ flow น้อย 6 h โดยทั่วไป 40 – 50 โคลนเป็นจำนวนต่ำสุดที่จะให้ผลลัพธ์น่าเชื่อถือ มีความใฝ่ ฝัน 3 – 4 ครั้ง ผ่านเข็ม 27 guage ผลักกับด้านข้างของหลอด มีวิธีง่าย ๆ ที่จะทำการระงับเซลล์ (ปณิธานจะดำเนินการหลังจากการเพิ่มปริมาณคราบเหมาะสมตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง) Nauplii กุ้งของขั้นตอนใด ๆ ให้เซลล์ผลขั้นต่ำหมายเลขต้องมีในช่วง 10-30 คน มีบริการเซลล์ที่เตรียมในรูปแบบเดียวกับโคลน flow ที่เชื่อถือได้ ในทำนองเดียวกัน protozoea, mysis และ postlarvae ของระยะใด ๆ ให้ flow ที่เชื่อถือได้เซลล์ผลลัพธ์ อย่างไรก็ตาม นี้สามารถดำเนินการในแต่ละบุคคลถ้าจำเป็น บริการ Protozoeal เซลล์สามารถเตรียมในรูปแบบเดียวกับโคลนขณะ mysis และบริการ postlarval เซลล์จะได้เตรียม โดยจริงคัฟ animal(s) ละ มีเคล็ดเปตต์ใส่ในท่อก่อนที่จะเพิ่มคราบ รูปที่ 2 summarises ขั้นตอนการเตรียมความพร้อมเหล่านี้3.3. ไม่ใช่แบบทำลายเนื้อเยื่อและ haemocyte เตรียมกล้ามเนื้อและเนื้อเยื่ออื่น ๆ จากกุ้งใหญ่ให้น่าเชื่อถือ flow cytometryresultsbysimplephysicalgrindingpriortoadditionofthestain Haemocyte กุ้งตัวอย่างให้ต้นดีเอ็นเอเตรียมกำหนดพล็อยดีใช้เซลล์ flow และสามารถนำไม่แก่ชีวิตเมื่อกุ้งถึงขนาดที่มี pleopod สามารถเอา (เช่น 2-3 กรัม) Haemocytes กุ้งควรหยุดในโซลูชั่น anticoagulant (Vargas Albores et al., 1993) และติดเพิ่ม (เช่นไม่มีไม่จริงตัดเซลล์ที่ต้องการ) ก่อนเพิ่มคราบ การเลือก centrifugationofthesuspensionfor5 minat6, 000 gfollowedby removalofthesupernatantcanbeperformedifthenumberofhaemocytes รวบรวมมีน้อย3.4 ควบคุม flow ภายในเซลล์หลังจากเตรียมบริการเซลล์กุ้งและเพิ่มปริมาณเหมาะสมของคราบ ตัวควบคุมมาตรฐานภายในเช่น fixed glutaral dehyde เซลล์เม็ดเลือดแดงไก่ (CRBC เตรียมจากไก่ erythrocytes) (โรบินสัน 1993) ควรรวม เมื่อตัวอย่างผ่านการ flow cytometer ให้ความสมบูรณ์ของผลการทดลอง ในสถานที่ดังกล่าวเตรียมจะ difficult ให้ หรือไม่ ว่าง ไก่เลือดผสมในทะเลฟอสเฟต ถูกบัฟเฟอร์โซลูชันสามารถใช้เป็นทางเลือก อย่างไรก็ตาม อายุการเก็บรักษาเป็นระยะสั้น (เช่น h 4-6) อื่นโดยทั่วไปใช้มาตรฐานการควบคุมภายในในเซลล์ flow เป็นเซลล์ เทราต์ (Beckman CoulterTM); อย่างไรก็ตาม พวกเขาไม่เหมาะสำหรับใช้กับกุ้งพล็อยดีวิเคราะห์เนื้อหาดีเอ็นเอจะคล้ายกับกุ้ง และสัญญาณแห่งทับซ้อน และไม่สามารถถูกแยกแยะจากกุ้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 การเตรียมการทั้งสัตว์ (ตัวอ่อนจนถึงระยะ postlarvae ต้น)
ในกุ้งตัวอ่อนประสบการณ์ของเราต้องมีอย่างน้อย 6 ชั่วโมงเก่าที่จะให้สัญญาณที่ชัดเจนและกำหนดระดับ ploidy ถูกต้องเมื่อใช้ชั้นโอ๊ยภูมิคุ้มกัน โดยทั่วไป 40-50 ตัวอ่อนเป็นจำนวนขั้นต่ำที่จะให้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือมีความทะเยอทะยาน, 3 ครั้งที่ 4 ผ่านเข็มวัด 27 ผลักดันให้กับด้านข้างของหลอดเป็นวิธีง่ายๆในการเตรียมเซลล์แขวนลอย (ความทะเยอทะยานจะดำเนินการหลังจากที่ การเพิ่มขึ้นของปริมาณที่เหมาะสมของคราบตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง) อาร์ทีกุ้งของขั้นตอนใดให้ชั้นเชื่อถือโอ๊ยผล cytometry มีจำนวนขั้นต่ำที่จำเป็นอยู่ในช่วง 10-30 บุคคลที่มีสารแขวนลอยเซลล์จัดทำในลักษณะเดียวกับตัวอ่อน ในทำนองเดียวกัน protozoea, mysis และระยะ postlarvae ของขั้นตอนใดให้ชั้นเชื่อถือโอ๊ย cytometry ผล; แต่นี้สามารถดำเนินการเกี่ยวกับบุคคลในกรณีที่จำเป็น เซลล์แขวนลอย Protozoeal สามารถเตรียมในลักษณะเดียวกับตัวอ่อนในขณะที่ mysis และสารแขวนลอยเซลล์ postlarval จัดทำโดยง่ายร่างกายบดสัตว์บุคคล (s) ด้วยปลายปิเปตผ่านการฆ่าเชื้อในหลอดก่อนที่จะมีการเพิ่มขึ้นของคราบ รูปที่ 2 สรุปขั้นตอนการเตรียมการเหล่านี้.
3.3 เนื้อเยื่อไม่ทำลายและการเตรียมเม็ดเลือด
กล้ามเนื้อและเนื้อเยื่ออื่น ๆ จากกุ้งขนาดใหญ่ให้ความน่าเชื่อถือชั้นโอ๊ย cytometryresultsbysimplephysicalgrindingpriortoadditionofthestain กุ้งตัวอย่างเม็ดเลือดให้แหล่งที่มาของดีเอ็นเอที่สะอาดสำหรับการกำหนด ploidy ใช้ชั้นโอ๊ยภูมิคุ้มกันและสามารถนำมาที่ไม่ทำลายครั้งเดียวกุ้งถึงขนาดที่ pleopod สามารถถอดออกได้ง่าย (เช่น 2-3 กรัม) เม็ดเลือดกุ้งควรจะถูกระงับในการแก้ปัญหาการแข็งตัวของเลือด (วาร์กัส-Albores et al., 1993) และคราบเพิ่ม (เช่นไม่มีการตัดของเซลล์ทางกายภาพที่จำเป็น) ก่อนที่จะมีการเพิ่มขึ้นของคราบ, ตัวเลือก centrifugationofthesuspensionfor5 minat6,000 gfollowedby removalofthesupernatantcanbeperformedifthenumberofhaemocytes เก็บอยู่ในระดับต่ำ.
3.4 ภายในชั้นควบคุม cytometry โอ๊ย
หลังจากการเตรียมสารแขวนลอยเซลล์กุ้งและการเพิ่มขึ้นของปริมาณที่เหมาะสมของคราบมาตรฐานการควบคุมภายในเช่น glutaral- dehyde Fi xed ไก่เม็ดเลือดแดง (CRBC เตรียมจากเม็ดเลือดแดงไก่) (โรบินสัน, 1993) ควรจะรวมเมื่อทำงาน ตัวอย่างผ่านชั้นโอ๊ย cytometer, เพื่อความสมบูรณ์ของผลการทดลอง ในสถานที่ที่การเตรียมการดังกล่าวยากที่จะทำหรือไม่สามารถใช้ได้เลือดไก่เจือจางในการแก้ปัญหาทางทะเลฟอสเฟตบัฟเฟอร์สามารถใช้เป็นทางเลือก; แต่อายุการเก็บรักษาสั้น (เช่น 4-6 ชั่วโมง) อีกประการหนึ่งที่นิยมใช้ในการควบคุมมาตรฐานภายในชั้นโอ๊ย cytometry เป็นเซลล์ปลาเทราท์ (Beckman CoulterTM); แต่พวกเขาจะไม่เหมาะสำหรับการใช้งานร่วมกับกุ้งวิเคราะห์ ploidy เป็นเนื้อหาดีเอ็นเอของพวกเขาจะคล้ายกับที่ของกุ้งและยอดสัญญาณทับซ้อนและไม่สามารถที่แตกต่างจากสิ่งที่ถูกต้องของกุ้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.2 . การเตรียมสัตว์ทั้งหมด ( เมื่อผ่านเร็วไป ? )
ในประสบการณ์ของเรา กุ้งแช่ ต้องมีอย่างน้อย 6 ชั่วโมงขึ้นไป เพื่อให้มีสัญญาณชัดเจน และกำหนดระดับการอย่างถูกต้องเมื่อใช้flโอ๊ย ( . โดยทั่วไป 40 – 50 ตัวเป็นจำนวนต่ำสุดที่จะให้ผลที่เชื่อถือได้ด้วยปณิธาน 3 – 4 ครั้งผ่านเข็ม 27 , ผลักกับด้านข้างของหลอดเป็นวิธีที่ง่ายที่จะเตรียมเซลล์แขวนลอย ( ปณิธาน จะดำเนินการหลังจากการเพิ่มของปริมาณที่เหมาะสมของคราบตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ) กุ้ง nauplii ของขั้นตอนใด ๆให้เชื่อถือได้flโอ๊ย ( ผลลัพธ์ ด้วยจำนวนขั้นต่ำที่ต้องอยู่ในช่วงของ 10 และ 30 บุคคลทั่วไป , เซลล์แขวนลอยที่เตรียมไว้ในลักษณะเดียวกันเป็นเอ็มบริโอ . protozoea เช่นเดียวกัน ,วัยอ่อนระยะใด ๆและให้อัตราflโอ๊ย ( ได้ผล อย่างไรก็ตาม นี้สามารถดำเนินการกับบุคคลที่ต้องการ เซลล์แขวนลอย protozoeal สามารถเตรียมในลักษณะเดียวกันเป็นเอ็มบริโอขณะวัยอ่อนและสารแขวนลอยเซลล์ postlarval ได้อย่างง่ายดายเตรียมร่างกายบดสัตว์บุคคล ( s ) ที่เป็นหมันไปเปตทิพในท่อก่อนการเพิ่มของคราบรูปที่ 2 summarises ขั้นตอนการเตรียมเหล่านี้ .
3 . ไม่ทำลายเนื้อเยื่อและกล้ามเนื้อและเนื้อเยื่ออื่น ๆ haemocyte การเตรียม
จากกุ้งขนาดใหญ่ให้เชื่อถือได้flโอ๊ย cytometryresultsbysimplephysicalgrindingpriortoadditionofthestain .กุ้ง haemocyte ตัวอย่างให้สะอาดหลังการใช้ดีเอ็นเอที่มาหาflโอ๊ย ( และสามารถถ่ายไม่ใช่ 91 เมื่อกุ้งถึงขนาดที่ pleopod สามารถลบออกได้อย่างง่ายดาย ( เช่น 2 – 3 กรัม ) เม็ดเลือดกุ้งควรจะระงับไว้ในโซลูชั่นเป็นเลือด ( วาร์กัส albores et al . , 1993 ) และคราบเพิ่ม ( เช่นไม่มีกายภาพตัดเซลล์ที่ต้องการ )ก่อนที่จะเพิ่มของคราบ , ตัวเลือก centrifugationofthesuspensionfor5 minat6000 gfollowedby removalofthesupernatantcanbeperformedifthenumberofhaemocytes เก็บต่ำ
3.4 . ภายในflโอ๊ย ( ควบคุม
หลังจากการเตรียมกุ้งเซลล์แขวนลอยและการเพิ่มปริมาณที่เหมาะสมของรอยเปื้อนภายในมาตรฐานการควบคุมเหมือน glutaral - dehyde จึง xed ไก่เม็ดเลือดแดง เม็ดเลือดแดง crbc เตรียมไก่ ) ( โรบินสัน , 1993 ) ควรจะรวมเมื่อใช้ตัวอย่างผ่านflโอ๊ยใช้โมโน เพื่อตรวจสอบความสมบูรณ์ของผลการทดลอง ในสถานที่เช่นการเตรียมการแยกศาสนาจึงให้ หรือไม่พร้อมใช้งานเลือดเจือจางในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ไก่ทะเลสามารถใช้เป็นทางเลือก แต่อายุการเก็บสั้น ( เช่น 4 ถึง 6 ชั่วโมง ) อื่นที่นิยมใช้ภายในมาตรฐานควบคุมflโอ๊ย ( เป็นปลาเทราท์เซลล์ ( แบคแมน coultertm ) ; อย่างไรก็ตามพวกเขาจะไม่เหมาะกับการใช้กับการวิเคราะห์กุ้งหลังเป็นเนื้อหาของดีเอ็นเอจะคล้ายกับที่ของกุ้งและยอดสัญญาณทับซ้อนกันและไม่สามารถถูกแตกต่างจากพวกกุ้ง