The culture conditions of the การเพ

The culture conditions of the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ such as culture temperature, C02 concentration, and 02 concentration can be determined as 20 appropriate. In this case, the cells may be cultured in the presence of a serum, a known โกร๊ตธ์แฟคเตอร์, and additives and chemical substances that promote growth. Examples of the known โกร๊ตธ์แฟคเตอร์ รวมถึง EGF, FGF and ที่คล้ายกัน. Examples of the additives that promote growth รวมถึง N2 supplement 25 (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen) and ที่คล้ายกัน. [0054] The production method 2 of the present การประดิษฐ์ is a method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet, ซึ่งประกอบรวมด้วย the following steps (1), (2), (3) and (4): 30 (1) a first step of subjecting pluripotent stem.cells to floating culture in a อาหารที่ปราศจากซีรัม เพื่อก่อตัวเป็น an กลุ่มก้อน of พีพี, (2) a second step of subjecting the กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้น in step (1) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum- 35 containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and containing a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing โปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา, 5 (3) a third step of subjecting the กลุ่มก้อน obtained in step (2) to การเพาะเลี้ยงแบบลอย in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum• containing อาหาร each being free of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the โซนิคเฮดจ์ฮอค วิถีการส่งสัญญาณ and a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ and containing a 10 substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the วิถีสัญญาณ Wnt, thereby obtaining an กลุ่มก้อน containing retina โปรเจนิเตอร์เซลล์, and (4) a fourth step of dispersing the กลุ่มก้อน obtained in step (3) and subjecting the resulting cells to การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ. [0055] 15 The step (1), step (2) and step (3) of the production method 2 of the การประดิษฐ์นี้ can be performed similarly to step (1), step (2) and step (3) of the production method 1 of the การประดิษฐ์นี้. [0056] 20 Step (4) for dispersing the กลุ่มก้อน obtained in step (3) and subjecting the resulting cells to adhesion culture is explained. [0057] Step (4) is performed within 60 days, ที่ควรใช้คือ within 25 30 days, more ที่ควรใช้คือ 3 days, after the start of step (3). [0058] The cells derived from the กลุ่มก้อนs dispersed in step (4) are seeded in an การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ container to a concentration capable of efficiently ที่ก่อตัวขึ้นเป็น a uniform sheet of 30 เรเร. For example, when cells derived from the กลุ่มก้อนs are subjected to การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ using a 65 mm Boyden chamber, a solution prepared to contain about lx103 ถึงประมาณ lx107 cells, ที่ควรใช้คือ about 3x103 ถึงประมาณ Sx106 cells, more ที่ควรใช้คือ about 5x103 ถึงประมาณ lx106 35 cells, further ที่ควรใช้คือ about 2x105 cells, per well is added to wells, and the plate is stood to allow the cells derived from the กลุ่มก้อนs to adhere and cultivate. [0059] Examples of the อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum-containing 5 อาหาร to be used for the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ in step (4) รวมถึง the aforementioned media. To avoid complicated formulation process, for example, a อาหารที่ปราศจากซีรัม supplemented with an appropriate amount of a สิ่งทดแทนซีรัม such as commercially available KSR (e.g., อาหาร โดยที่ 1:1 mixture of DMEM/F-12 10 and Neurobasal is added with 1/2x N2 supplement, l/2x 827 supplement and 100 µM 2-เมอร์แคปโตเอธานอล) is ที่ควรใช้คือ used. The concentration of KSR to be added to a อาหารที่ปราศจากซีรัม is generally about 1% ถึงประมาณ 20%, ที่ควรใช้คือ about 2% ถึงประมาณ 20%, in the case of, for example, cells derived from human ES 15 cells. [0060] In step (4), the cells are ที่ควรใช้คือ cultured in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or serum-containing อาหาร containing a ROCK inhibitory substance. 20 [0061] The ROCK inhibitory substance is a substance capable of inhibiting a signal mediated via a Rho kinase. Examples of the ROCK inhibitory substance รวมถึง Y-27632 and Fasudil. The concentration of a ROCK inhibitory substance to be 25 used in step (4) may be any as long as a uniform sheet of เรเร can be efficiently formed. For example, in the case of Y-27632, it is added at a concentration of about 0.01 µM ถึงประมาณ 100 µM, ที่ควรใช้คือ about 1 µM ถึงประมาณ 30 µM, more ที่ควรใช้คือ about 20 µM. 30 [ 0 0 62] In step (4), it is more preferable to culture the cells in a อาหารที่ปราศจากซีรัม or อาหารที่มีซีรัม further containing one or more substances selected from the group consisting of a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the วิถีสัญญาณ Wnt, a 35 substance inhibiting the วิถีสัญญาณ FGF, a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อthe แอคทิวิน signal pathway and a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP วิถีการส่งสัญญาณ. [0063] Examples of the substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the Wnt signal 5 pathway รวมถึง protein belonging to Wnt family (e.g., Wntl, Wnt3a, Wnt7a), Wnt รีเซปเตอร์ อะโกนิสต์, GSK3~ inhibitor (e.g., 6- Bromoindirubin-3'-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) and ที่คล้ายกัน.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สามารถกำหนดเงื่อนไขวัฒนธรรมของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ เช่นวัฒนธรรมอุณหภูมิ ความเข้มข้น C02, 02 ความเข้มข้นเหมาะสม 20 ในกรณีนี้ เซลล์อาจ cultured ในเซรั่ม โกร๊ตธ์แฟคเตอร์รู้จักกัน และสารเติมแต่ง และสารเคมีที่ส่งเสริมการเจริญเติบโต ตัวอย่างของ FGF, EGF รู้จักโกร๊ตธ์แฟคเตอร์รวมถึง และที่คล้ายกัน ตัวอย่างของสารที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตรวมถึง N2 เสริม 25 (Invitrogen), B27 เสริม (Invitrogen) และที่คล้ายกัน [0054] วิธีทำ 2 การประดิษฐ์ปัจจุบันคือ วิธีการผลิตแผ่นเยื่อบุผิวเซลล์เม็ดสีที่จอประสาทตา ซึ่งประกอบรวมด้วยต่อไปนี้ (1), (2), (3) และ (4): 30 (1) ขั้นตอนแรกของเรื่อง pluripotent stem.cells ให้ลอยวัฒนธรรมในการเพื่อก่อตัวเป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมกลุ่มก้อนการของพีพี, (2) ขั้นตอนสองของเรื่องกลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ (1) การการเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือคอนเซรั่ม-35taining อาหารที่แต่ละจะฟรีของการสารที่ออกฤทธิ์ต่อโซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณ และที่ออกฤทธิ์ต่อเป็นสารที่ประกอบด้วย BMP วิถีการส่งสัญญาณ จึงได้รับการกลุ่มก้อนโปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา 5 (3) ที่ประกอบด้วยขั้นตอนสามของเรื่องกลุ่มก้อนได้รับในขั้น (2) การการเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือ serum• ที่ประกอบด้วยอาหารละจะฟรีของที่ออกฤทธิ์ต่อมีสารโซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณ และการสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณและที่ประกอบด้วยการที่ออกฤทธิ์ต่อสาร 10 วิถีสัญญาณ Wnt จึงได้รับการกลุ่มก้อนที่ประกอบด้วยจอตาโปรเจนิเตอร์เซลล์ และ (4) ขั้นสี่สลายกลุ่มก้อนได้รับในขั้นตอนที่ (3) และเรื่องผลเซลล์เพื่อการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ [0055] 15 ขั้นตอนที่ (1), ขั้นตอนที่ (2) และ (3) ของวิธีการผลิต 2 ของการประดิษฐ์นี้สามารถดำเนินการในทำนองเดียวกันกับขั้นตอนที่ (1), ขั้นตอนที่ (2) และ (3) วิธีการผลิต 1 การการประดิษฐ์นี้ [0056] ขั้นตอนที่ 20 (4) สลายกลุ่มก้อนได้รับในขั้นตอนที่ (3) และเรื่องเซลล์ผลลัพธ์ให้ยึดวัฒนธรรมอธิบาย ขั้นตอน [0057] (4) ดำเนินการภายใน 60 วัน ที่ควรใช้คือภายในระยะเวลา 30 วัน ที่ควรใช้คือเพิ่มเติม 3 วัน หลังจากขั้นตอนที่ (3) [0058] เซลล์ที่ได้มาจาก กลุ่มก้อนs ที่กระจายตัวในขั้นตอนที่ (4) ยานยนต์ในการคอนเทนเนอร์การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะที่ความเข้มข้นที่สามารถมีประสิทธิภาพที่ก่อตัวขึ้นเป็น 30 เรเรแผ่นเหมือนกัน ตัวอย่างเช่น เมื่อเซลล์ที่ได้มาจาก กลุ่มก้อนs อยู่ภายใต้การการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ ใช้ Boyden หอการค้า โซลูชั่นที่พร้อมประกอบด้วยเกี่ยวกับเซลล์ lx103 ถึงประมาณ lx107 ที่ควรใช้คือประมาณ 3 x 103 เซลล์ถึงประมาณ Sx106 ที่ควรใช้คือเพิ่มเติมประมาณ 5 x 103 เซลล์ถึงประมาณ lx106 35, 65 มม.เพิ่มเติม ที่ควรใช้คือประมาณ 2 x 105 เซลล์ ต่อถูกเพิ่มลงในช่อง และจานเป็นยืนให้เซลล์ที่ได้มาจาก กลุ่มก้อนs เพื่อปฏิบัติ และปลูกฝัง ตัวอย่าง [0059] ของการอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่มที่ประกอบด้วยอาหาร 5 จะใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะในขั้นตอนที่ (4) รวมถึงสื่อดังกล่าว เพื่อหลีกเลี่ยงสูตรซับซ้อนกระบวน เช่น อาหารที่ปราศจากซีรัมที่เสริม ด้วยจำนวนสิ่งทดแทนซีรัมเหมาะสมเช่นในเชิงพาณิชย์มี KSR (เช่น อาหารโดยที่ 1:1 ส่วนผสมของ DMEM/F-12 10 และ Neurobasal เพิ่ม ด้วย 1/2 x N2 เสริม l/2 x 827 เสริมและ 100 µM 2-เมอร์แคปโตเอธานอล) เป็นที่ควรใช้คือที่ใช้ ความเข้มข้นของ KSR ที่จะเพิ่มเป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมโดยทั่วไปประมาณ 1% 20% ถึงประมาณ ที่ควรใช้คือประมาณ 2% ถึงประมาณ 20% ในกรณีของ เช่น เซลล์ได้มาจากมนุษย์ ES 15 เซลล์ [0060] ในขั้นตอนที่ (4), เซลล์อยู่ที่ควรใช้คือในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรืออาหารที่ประกอบด้วยซีรั่มที่ประกอบด้วยสารยับยั้งหินล้าง 20 [0061] ร็อคยับยั้งสารเป็นสารที่สามารถยับยั้งสัญญาณสื่อผ่านไคเนสรี Rho ตัวอย่างของรวมถึงยับยั้งสารหิน Y-27632 และ Fasudil ความเข้มข้นของสารยับยั้งหินจะ ใช้ในขั้นตอนที่ (4) 25 อาจใด ๆ ตราบเท่าที่แผ่นชุดของเรเรสามารถเกิดขึ้นได้อย่างมีประสิทธิภาพ เช่น ในกรณีของ Y-27632 เพิ่มที่ความเข้มข้นประมาณ 0.01 µM ถึงประมาณ 100 µM ที่ควรใช้คือประมาณ 1 µM ถึงประมาณ 30 µM ที่ควรใช้คือเพิ่มเติมเกี่ยวกับ 20 µM. 30 [0 0 62] ในขั้นตอนที่ (4), ก็เป็นที่นิยมมากขึ้นวัฒนธรรมเซลล์ในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรืออาหารที่มีซีรัมเพิ่มเติม ประกอบด้วยอย่างใดอย่างหนึ่ง หรือเลือกสารเพิ่มเติมจากกลุ่มที่ประกอบด้วยการที่ออกฤทธิ์ต่อสารวิถีสัญญาณ Wnt , 35 สารยับยั้งวิถีสัญญาณ FGF แอคทิวิน ที่ออกฤทธิ์ต่อthe สารเป็นสัญญาณทางเดินและสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณ [0063] ตัวอย่างของที่ออกฤทธิ์ต่อสาร Wnt สัญญาณเดิน 5 รวมถึงโปรตีน Wnt ในครอบครัว (เช่น Wntl, Wnt3a, Wnt7a), Wnt รีเซปเตอร์อะโกนิสต์ GSK3 ~ ยับยั้ง (เช่น 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) และที่คล้ายกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เงื่อนไขวัฒนธรรมของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะเช่นอุณหภูมิวัฒนธรรมความเข้มข้น C02 และความเข้มข้น 02 สามารถกำหนดได้ถึง 20 เหมาะสม ในกรณีนี้เซลล์อาจจะเพาะเลี้ยงในการปรากฏตัวของเซรั่มที่รู้จักกันโกร๊ตธ์แฟคเตอร์และสารเติมแต่งและสารเคมีที่ส่งเสริมการเจริญเติบโต ตัวอย่างที่รู้จักกันเป็นโกร๊ตธ์แฟคเตอร์รวมถึง EGF, FGF และที่คล้ายกัน ตัวอย่างของสารเติมแต่งที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตรวมถึงอาหารเสริม N2 25 (Invitrogen) B27 เสริม (Invitrogen) และที่คล้ายกัน [0054] วิธีการผลิตที่ 2 ของการปัจจุบันประดิษฐ์เป็นวิธีการในการผลิตแผ่นเซลล์เม็ดสีเยื่อบุผิวจอประสาทตาที่ซึ่งประกอบรวม​​ด้วยขั้นตอนดังต่อไปนี้ (1) (2) (3) และ (4): 30 (1 ) เป็นขั้นตอนแรกของหนอนบ่อนไส้ stem.cells pluripotent วัฒนธรรมลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมเพื่อก่อตัวเป็นกลุ่มก้อนของพีพี (2) ขั้นตอนที่สองของหนอนบ่อนไส้กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ (1 ) เพื่อการเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือ serum- 35 มีอาหารแต่ละเป็นอิสระของสารที่ออกฤทธิ์ต่อโซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณและมีสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณดังนั้นการได้รับกลุ่มก้อนที่มีโปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา, 5 (3) ขั้นตอนที่สามของหนอนบ่อนไส้กลุ่มก้อนได้ในขั้นตอนที่ (2) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจาก ซีรัมหรือเซรั่ม•มีอาหารแต่ละเป็นอิสระของสารที่ออกฤทธิ์ต่อโซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณและสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณและมี 10 สารที่ออกฤทธิ์ต่อวิถี สัญญาณ Wnt ดังนั้นการได้รับกลุ่มก้อนที่มีม่านตาโปรเจนิเตอร์เซลล์และ (4) เป็นขั้นตอนที่สี่ของการกระจายกลุ่มก้อนรับในขั้นตอน (3) และหนอนบ่อนไส้เซลล์ที่เกิดขึ้นเพื่อการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ [0055] 15 ขั้นตอน (1) ขั้นตอน (2) และขั้นตอน (3) วิธีการผลิตที่ 2 ของการประดิษฐ์นี้สามารถดำเนินการในทำนองเดียวกันกับขั้นตอนที่ (1) ขั้นตอน (2) และขั้นตอน (3) ของ วิธีการผลิตที่ 1 ของการประดิษฐ์นี้ [0056] 20 ขั้นตอนที่ (4) สำหรับการกระจายกลุ่มก้อนรับในขั้นตอน (3) และหนอนบ่อนไส้เซลล์ที่เกิดวัฒนธรรมการยึดเกาะที่จะมีการอธิบาย [0057] ขั้นตอนที่ (4) จะดำเนินการภายใน 60 วันที่ควรใช้คือภายใน 25 30 วันอื่น ๆ ที่ควรใช้คือ 3 วันหลังจากที่เริ่มต้นของขั้นตอน (3) [0058] เซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อน s แยกย้ายกันไปในขั้นตอนที่ (4) เมล็ดในการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะภาชนะความเข้มข้นความสามารถในการได้อย่างมีประสิทธิภาพที่ก่อตัวขึ้นเป็นแผ่นเครื่องแบบ 30 เรเร ตัวอย่างเช่นเมื่อเซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อน s อยู่ภายใต้การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะใช้ 65 มมห้อง Boyden แก้ปัญหาเตรียมที่จะมีประมาณ lx103 ถึงประมาณ lx107 เซลล์ที่ควรใช้คือประมาณ 3x103 ถึงประมาณเซลล์ Sx106, อื่น ๆ อีกมากมายที่ควรใช้คือประมาณ 5x103 ถึงประมาณ 35 lx106 เซลล์ต่อไปที่ควรใช้คือประมาณ 2x105 เซลล์ต่อกันถูกเพิ่มลงในหลุมและจานนั้นจะยืนอยู่ที่จะช่วยให้เซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อนที่จะปฏิบัติตามและปลูกฝัง [0059] ตัวอย่างของอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่มที่มีส่วนผสมของ 5 อาหารที่จะใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะในขั้นตอนที่ (4) รวมถึงสื่อดังกล่าวข้างต้น เพื่อหลีกเลี่ยงกระบวนการสูตรที่ซับซ้อนเช่นอาหารที่ปราศจากซีรัมเสริมด้วยปริมาณที่เหมาะสมของสิ่งทดแทนซีรัมเช่นใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ KSR (เช่นอาหารโดยที่ 1: 1 ผสม DMEM / F-12 10 และ Neurobasal จะเพิ่มด้วย 1 / 2x N2 เสริม, L / 2x 827 อาหารเสริมและ 100 ไมครอน 2- เมอร์แคปโตเอธานอล) เป็นที่ควรใช้คือใช้ ความเข้มข้นของ KSR ที่จะเพิ่มให้เป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมโดยทั่วไปประมาณ 1% ถึงประมาณ 20% ที่ควรใช้คือประมาณ 2% ถึงประมาณ 20% ในกรณีของตัวอย่างเช่นเซลล์ที่ได้มาจากมนุษย์ ES 15 เซลล์. [0060] ในขั้นตอน (4) เซลล์ที่มีที่ควรใช้คือการเพาะเลี้ยงในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่มที่มีส่วนผสมของอาหารที่มีสารยับยั้ง ROCK 20 [0061] สารยับยั้งร็อคเป็นสารที่มีความสามารถในการยับยั้งสัญญาณพึ่งผ่านไคเนโร ตัวอย่างของสารยับยั้ง ROCK รวมถึง Y-27632 และ Fasudil ความเข้มข้นของสารยับยั้ง ROCK 25 ที่จะใช้ในขั้นตอน (4) อาจจะเป็นใด ๆ ตราบเท่าที่แผ่นเครื่องแบบเรเรสามารถเกิดขึ้นได้อย่างมีประสิทธิภาพ ยกตัวอย่างเช่นในกรณีของ Y-27632 ก็จะมีการเพิ่มความเข้มข้นประมาณ 0.01 ไมครอนถึงประมาณ 100 ไมโครเมตรที่ควรใช้คือประมาณ 1 ไมครอนถึงประมาณ 30 ไมโครเมตรเพิ่มเติมที่ควรใช้คือประมาณ 20 ไมครอน 30 [0 0 62] ในขั้นตอน (4) เป็นที่นิยมมากขึ้นในการเพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรืออาหารที่มีซีรัมเพิ่มเติมที่มีหนึ่งหรือมากกว่าสารที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วยสารที่ออกฤทธิ์ต่อ วิถีสัญญาณ Wnt, 35 สารยับยั้งการทำงานของวิถีสัญญาณ FGF สารที่ออกฤทธิ์ต่อแอคทิวินทางเดินของสัญญาณและสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP วิถีการส่งสัญญาณ [0063] ตัวอย่างของสารที่ออกฤทธิ์ต่อ Wnt สัญญาณ 5 เดินรวมถึงโปรตีนที่อยู่ในครอบครัว Wnt (เช่น Wntl, Wnt3a, Wnt7a) Wnt รีเซปเตอร์อะโกนิสต์, GSK3 ~ ยับยั้ง (เช่น 6 - Bromoindirubin-3- oxime (BIO) CHIR99021, Kenpaullone) และที่คล้ายกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัฒนธรรมของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะเงื่อนไข เช่น อุณหภูมิ และความเข้มข้นของวัฒนธรรม C02 , 02 สามารถกำหนดเป็น 20 ที่เหมาะสม ในกรณีนี้ , เซลล์อาจจะเพาะในตนของ เซรั่ม , รู้จักโกร๊ตธ์แฟคเตอร์และวัตถุเจือปน และสารเคมีที่ส่งเสริมการเจริญเติบโต ตัวอย่างที่รู้จักกันโกร๊ตธ์แฟคเตอร์รวมถึง EGF fgf ที่คล้ายกัน , และ . ตัวอย่างของวัตถุที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตรวมถึง N2 เสริม 25 ( Invitrogen ) b27 เสริม ( Invitrogen ) และที่คล้ายกัน . [ ที่ ] วิธีการผลิตที่ 2 ของการประดิษฐ์ปัจจุบันคือวิธีการผลิตแผ่นเซลล์เม็ดสีม่านตาเยื่อบุผิว , ซึ่งประกอบรวมด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) และ ( 4 ) : 30 ( 1 ) ขั้นตอนแรกของ subjecting พลูริโพเทนท์ stem.cells วัฒนธรรมที่ลอยอยู่ในอาหารที่ปราศจากซีรัมเพื่อก่อตัวเป็นเป็นกลุ่มก้อนของ พีพี ( 2 ) ขั้นตอนที่สองของการลงโทษที่กลุ่มก้อนที่ก่อตัวขึ้นในขั้นตอนที่ ( 1 ) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่ม - 35 ที่มีต าหารแต่ละถูกฟรีของสารที่ออกฤทธิ์ต่อที่โซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณและบรรจุสารที่ออกฤทธิ์ต่อการ BMP วิถีการส่งสัญญาณจึงได้รับกลุ่มก้อนที่มีโปรเจนิเตอร์เซลล์ของจอประสาทตา 5 ( 3 ) ขั้นตอนที่สามของกลุ่มก้อน subjecting ที่ได้ในขั้นตอนที่ ( 2 ) การเพาะเลี้ยงแบบลอยในอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่ม - ที่มีอาหารแต่ละเป็นสารทีฟรี ่ออกฤทธิ์ต่อที่โซนิคเฮดจ์ฮอควิถีการส่งสัญญาณและสารที่ออกฤทธิ์ต่อการ BMP วิถีการส่งสัญญาณประกอบด้วย 10 และสารที่ออกฤทธิ์ต่อที่วิถีสัญญาณช่อง WNT จึงได้รับกลุ่มก้อนที่มีจอตาโปรเจนิเตอร์เซลล์และ ( 4 ) ขั้นตอนที่สี่ของการแยกออกกลุ่มก้อนได้ในขั้นตอนที่ ( 3 ) และ subjecting ส่งผลให้เซลล์การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ . [ 0055 ] 15 ขั้นตอน ( 1 ) ขั้นตอน ( 2 ) และ ( 3 ) ขั้นตอนของวิธีการผลิตที่ 2 ของการประดิษฐ์นี้สามารถดำเนินการ 3 ขั้นตอน ( 1 ) ขั้นตอน ( 2 ) และ ( 3 ) ขั้นตอนของการผลิต วิธีที่ 1 ของการประดิษฐ์นี้ . [ 0056 ] 20 ขั้น ( 4 ) เพื่อกลุ่มก้อนแยกออกได้ในขั้นตอนที่ ( 3 ) และ subjecting ส่งผลให้เซลล์ยึดเกาะ วัฒนธรรม คือ อธิบาย [ 0057 ] ขั้นตอนที่ ( 4 ) จะดำเนินการภายใน 60 วัน ที่ควรใช้คือภายใน 25 30 วัน ที่ควรใช้คือมากกว่า 3 วัน หลังจากการเริ่มขั้นตอน ( 3 ) [ 0058 ] เซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อน s กระจายตัวในขั้นตอน ( 4 ) เมล็ดในภาชนะการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะเพื่อสมาธิสามารถมีประสิทธิภาพที่ก่อตัวขึ้นเป็นแผ่นชุด 30 เรเร . ตัวอย่างเช่น เมื่อเซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อน S จะต้องใช้การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ 65 มิลลิเมตร บอยเดนห้อง , เตรียมสารละลายให้มีประมาณ lx103 ถึงประมาณ lx107 เซลล์ ที่ควรใช้คือเกี่ยวกับ 3x103 ถึงประมาณ sx106 เซลล์ ที่ควรใช้คือเพิ่มเติมเกี่ยวกับ 5x103 ถึงประมาณ lx106 35 เซลล์ ที่ควรใช้คือเพิ่มเติมเกี่ยวกับ 2x105 เซลล์ ต่อได้เป็นอย่างดี เพิ่มเวล และจาน จะยืนอยู่เพื่อให้เซลล์ที่ได้มาจากกลุ่มก้อนเพื่อยึดติด และฝึกฝน [ 0059 ] ตัวอย่างของอาหารที่ปราศจากซีรัมหรือเซรั่ม ที่มี 5 อาหารที่จะใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะในขั้นตอนที่ ( 4 ) รวมถึงสื่อดังกล่าว เพื่อหลีกเลี่ยงการกำหนดกระบวนการที่ซับซ้อน เช่น อาหารที่ปราศจากซีรัมเสริมด้วยปริมาณที่เหมาะสมของสิ่งทดแทนซีรัมเช่นอาด KSR ( เช่น อาหารโดยที่ 1 : 1 ผสม