The viral RNA was extractedfrom the

The viral RNA was extracted
from the purified virion by the QIAamp
Viral RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany).
The first strand of cDNA was synthesized
from the viral RNAs by a cDNA
synthesis kit (Stratagene, La Jolla, CA)
with the addition of an oligo-dT primer.
Subsequently, one set of primers designed
by Pappu et al. (20) was used to amplify
the 3
terminal regions of YC5 and RC4
RNAs via polymerase chain reaction
(PCR). The exTaq polymerase (TaKaRa,
Shuzo Co., Shiga, Japan) was used for the
PCR amplification for 25 cycles (Gene-
Amp system 2400; Perkin-Elmer, Norwalk,
CT) using the following program: denaturing
at 94°C for 1 min, annealing at 51°C
for 30 s, and DNA synthesis at 72°C for 2
min. For amplification of RC4, all reaction
steps and conditions were the same as
those for YC5, except that annealing was
done at 45°C for 50 s. An elongation step
at 72°C for 6 min was conducted at the last
cycle for both isolates. Amplified products
were analyzed by electrophoresis in a 1.2%
agarose gel and subsequently cloned into a
pCRII-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad,
CA) according to manufacturer’s instruction.
Plasmid clones with expected DNA
inserts were selected for sequence analyses.
Sequencing of the target DNA was
done by an automatic DNA sequencer
(ABI PRISM 377; Perkin-Elmer, Applied
Biosystems Division) with the BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (Perkin-Elmer). Nucleotide sequence
of each virus isolate was determined from
three to four independent clones. Sequence
data was analyzed and compared with
those of known potyvirus species by the
program of Vector NTI Suite (InforMax,
Inc., Bethesda, MD).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อาร์เอ็นเอไวรัสที่ถูกสกัด
จาก virion บริสุทธิ์โดย QIAamp
ไวรัส RNA ชุดมินิ (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี).
สาระแรกของ cDNA ถูกสังเคราะห์
จาก RNAs ไวรัสโดยยีน
ชุดสังเคราะห์ (Stratagene, La Jolla, CA)
ด้วย นอกเหนือจากไพรเมอร์ Oligo-dT.
ต่อมาชุดหนึ่งของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบ
โดย Pappu และคณะ (20) ถูกใช้ในการขยาย
3? ภูมิภาคขั้ว YC5 และ RC4
RNAs ผ่านวิธี Polymerase chain reaction
(PCR) โพลิเมอร์ exTaq (TaKaRa,
Shuzo Co. , Shiga, ญี่ปุ่น) ที่ใช้สำหรับการ
ขยาย PCR 25 รอบ (Gene-
ระบบแอมป์ 2400; Perkin-Elmer วอล์ค,
CT) โดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้: denaturing
ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที, การอบที่ 51 ° C
เป็นเวลา 30 วินาที, และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2
นาที สำหรับการขยายของ RC4 ทั้งหมดปฏิกิริยา
ขั้นตอนและเงื่อนไขเดียวกับ
ที่สำหรับ YC5 ยกเว้นหลอมที่ได้รับการ
ทำที่ 45 ° C เป็นเวลา 50 วินาที ขั้นตอนการยืดตัว
ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 นาทีได้รับการดำเนินการที่ผ่านมา
รอบสำหรับสายพันธุ์ทั้งสอง ผลิตภัณฑ์ขยาย
นำมาวิเคราะห์โดย electrophoresis ใน 1.2%
เจล agarose และโคลนต่อมาเป็น
เวกเตอร์ pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad,
CA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.
โคลนพลาสมิดที่มีดีเอ็นเอคาดว่า
แทรกถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ลำดับ.
ลำดับของดีเอ็นเอเป้าหมาย ได้รับการ
ทำโดยซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ
(ABI PRISM 377; Perkin-Elmer ประยุกต์
Biosystems กอง) กับ Terminator BigDye
วงจรลำดับพร้อมปฏิกิริยา
Kit (Perkin-Elmer) ลำดับเบส
ของเชื้อราไวรัสแต่ละตัวถูกกำหนดจาก
สามถึงสี่โคลนอิสระ ลำดับ
วิเคราะห์ข้อมูลและเปรียบเทียบกับ
ผู้สายพันธุ์ potyvirus ที่รู้จักกันโดย
โปรแกรมของเวกเตอร์ NTI สวีท (Informax,
Inc. , Bethesda, MD)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยีนของไวรัสสกัด
จากบริสุทธิ์ไวริออนโดย qiaamp
ไวรัส RNA ขนาดเล็กชุด ( เพิ่มฮิลเดน , เยอรมนี )

สาระแรกของยีนสังเคราะห์จาก RNAs ไวรัสโดยยีนสังเคราะห์ชุด ( stratagene
,
La Jolla , CA ) ด้วยการเพิ่มของโอลิโกเมอร์
DT . ต่อมาชุดไพรเมอร์ที่ออกแบบ
โดย บับบู et al . ( 20 ) ถูกใช้เพื่อขยาย
3
สถานีภูมิภาคของ yc5 rc4
และRNAs ผ่านปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส
( PCR ) การใช้ extaq ( Takara
ชูโซะ , จําชิงะ , ญี่ปุ่น ) ใช้
PCR ( 25 รอบ ( ยีน -
amp ระบบ 2400 ; เพอร์กินเอลเมอร์ Norwalk , CT ,
) โดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้ : ี่ 94 ° C
ที่ 1 นาทีที่ 51 ° C
ขนาด 30 เ และดีเอ็นเอสังเคราะห์ที่ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที สำหรับการเพิ่ม

rc4 ทุกขั้นตอนและเงื่อนไขเป็นปฏิกิริยาเดียวกับ
ผู้ yc5 ยกเว้น annealing คือ 45 ° C
ทำ 50 . การยืดขั้นตอนที่ 72 ° C
6 นาทีที่ใช้ในรอบสุดท้าย
ทั้งเชื้อ ขยายผลิตภัณฑ์
วิเคราะห์โดย electrophoresis ในเจล ( 1.2% และต่อมาเป็น

ตัว pcrii Topo เวกเตอร์ ( Invitrogen Carlsbad , CA ,
) ตามคำสั่งของผู้ผลิต พลาสมิดดีเอ็นเอ

โคลนกับคาดแทรกสุ่มการวิเคราะห์ลำดับ การหาลำดับเบสของดีเอ็นเอเป้าหมาย

ทำโดยอัตโนมัติ DNA sequencer
( ABI ปริซึม 377 ซึ่งใช้เพอร์กินเอลเมอร์ กอง

) กับ bigdye Terminator รอบลำดับชุดปฏิกิริยา
พร้อม ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไวรัสแต่ละแยกพิจารณา

จากสามถึงสี่สายพันธุ์ที่เป็นอิสระ ลำดับข้อมูลการวิเคราะห์และเปรียบเทียบกับ

โพตีไวรัสชนิดที่รู้จักกันโดย
โปรแกรมเวกเตอร์ NTI แต่งงาน ( informax
, อิงค์ , Bethesda , MD )