Leaf samples were collected from fo

Leaf samples were collected from four symptomatic plants
of each of the rice varieties ADT 43, CO 39 and White Ponni
(collected from TNAU farms, Coimbatore district) and BPT
5204 (from the Erode district) and used for the present study. A
modified CTAB method (Warokka et al. 2006) was used for the
extraction of total DNA from leaf samples of rice for detecting
phytoplasmas. Nested-PCR assays with the universal primer
pair P1/P7 followed by the universal primer pair R16F2/R2,
designed to amplify a portion of the 16S rRNA gene (Lee et al.
1993; Gundersen and Lee 1996) were employed. One
microlitre of DNA was used for first round amplification with
primer pair P1/P7 and 0.5 μl of first round product was used as
template in nested-PCR without dilution with phytoplasma
specific primers R16F2n/R16R2. A total of 35 thermal cycles
were carried out which included denaturation for 1 min (2 min
for first cycle) at 94 °C, annealing for 2 min at 50 °C and
extension for 3 min (10 min in final cycle) at 72 °C. DNA
fragments ca. 1.2 kb in size were amplified by nested-PCR
(Fig. 2) from DNA extracts of symptomatic leaves from the
infected plants but not from the DNA of healthy leaves. The
nested-PCR was repeated thrice using the same samples. The
DNA fragments were gel purified using a gel extraction kit
(Qiagen, New Delhi, India) and cloned in plasmid (pGEMT®
vector- Promega). The Plasmid DNAwas directly sequenced in
both orientations at SciGenom Labs Pvt Ltd, Kerala, India and the subsequent 1,179 bp of the sequence were aligned with
ClustalW(Thompson et al. 1994). The NCBI BLAST program
was used to scan the sequence data against other phytoplasma
16S rRNA gene sequences. A phylogenetic tree was
constructed by the neighbour joining method using the
MEGA software version 5 (Saitou and Nei 1987; Tamura
et al. 2011).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างใบถูกเก็บรวบรวมจากอาการพืช 4แต่ละพันธุ์ข้าว ADT 43, CO 39 และ Ponni สีขาว(รวบรวมจากฟาร์ม TNAU เขตคอมบาทอรี่) และ BPT5204 (จากอำเภอ Erode) และใช้ในการศึกษาปัจจุบัน Aปรับเปลี่ยนวิธี CTAB (Warokka et al. 2006) ใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอทั้งหมดจากตัวอย่างใบข้าวสำหรับการตรวจสอบphytoplasmas Assays PCR ซ้อนกับพื้นสากลคู่ P1/P7 ตาม ด้วยรองพื้นสากลคู่ R16F2/R2ออกแบบมาเพื่อขยายส่วนของยีนใน rRNA 16S (Lee et al1993 Gundersen และ 1996 ลี) ได้ว่าจ้าง หนึ่งใช้สำหรับขยายรอบแรกกับ microlitre ของดีเอ็นเอใช้เป็นรองพื้นคู่ P1/P7 และ 0.5 μl ของรอบแรกแบบซ้อน PCR โดยไม่ต้องเจือจางกับ phytoplasmaเฉพาะไพรเมอร์ R16F2n/R16R2 จำนวน 35 ความร้อนรอบได้ดำเนินการซึ่งรวม denaturation ใน 1 นาที (2 นาทีสำหรับรอบแรก) ที่ 94 ° C การอบเหนียวสำหรับ 2 นาทีที่ 50 ° C และส่วนขยายใน 3 นาที (10 นาทีในรอบสุดท้าย) ที่ 72 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอบางส่วนของ ca 1.2 กิโลไบต์ในขนาดที่ขยาย โดย PCR ซ้อน(Fig. 2) จากดีเอ็นเอบางส่วนของอาการออกจากการพืชที่ติดเชื้อแต่ไม่ใช่ จากดีเอ็นเอของใบไม้ที่มีสุขภาพดี ที่PCR ซ้อนถูกซ้ำสามครั้งโดยใช้ตัวอย่างเดียวกัน ที่ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์ใช้ชุดสกัดเจเจ(Qiagen นิวเดลี อินเดีย) และโคลนใน plasmid (pGEMT ®เวกเตอร์-Promega) DNAwas Plasmid ที่เรียงลำดับโดยตรงในทั้งสองแนวที่ SciGenom Labs Pvt Ltd, Kerala อินเดีย และ 1,179 ต่อมา bp ของลำดับสอดคล้องกับClustalW (ทอมป์สันและ al. ปี 1994) โปรแกรมระเบิด NCBIใช้การสแกนข้อมูลลำดับกับ phytoplasma อื่น ๆ16S rRNA ยีนลำดับ ต้นไม้ phylogeneticสร้าง โดยเพื่อนบ้านที่เข้าร่วมโดยใช้วิธีการเมก้าซอฟแวร์รุ่น 5 (Saitou และ Nei 1987 Tamuraร้อยเอ็ด al. 2011)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างใบที่ถูกเก็บรวบรวมจากสี่พืชที่มีอาการ
ของแต่ละพันธุ์ข้าว ADT 43, 39 และ CO ขาว PONNI
(เก็บมาจากฟาร์ม TNAU อำเภอ Coimbatore) และ BPT
5204 (จากย่านกัดเซาะ) และใช้สำหรับการศึกษาปัจจุบัน
การปรับเปลี่ยนวิธี CTAB (Warokka et al. 2006) ที่ใช้สำหรับ
การสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างรวมใบข้าวสำหรับการตรวจสอบ
ไฟโตพลาสมา ตรวจซ้อน-PCR ด้วยไพรเมอร์สากล
คู่ P1 / P7 ตามด้วยไพรเมอร์สากลคู่ R16F2 / R2 การ
ออกแบบมาเพื่อขยายส่วนของยีน 16S rRNA (Lee et al.
1993; Gundersen และลี 1996) ถูกว่าจ้าง หนึ่ง
ไมโครลิตรของดีเอ็นเอที่ใช้สำหรับการขยายรอบแรกกับ
คู่ไพรเมอร์ P1 / P7 และ 0.5 ไมโครลิตรของผลิตภัณฑ์รอบแรกถูกใช้เป็น
แม่แบบในการซ้อนกัน-PCR โดยไม่ต้องเจือจางด้วย phytoplasma
ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง R16F2n / R16R2 ทั้งหมด 35 รอบความร้อน
ได้ดำเนินการซึ่งรวมถึงการสูญเสียสภาพธรรมชาติเป็นเวลา 1 นาที (2 นาที
สำหรับรอบแรก) ที่ 94 องศาเซลเซียสอบเป็นเวลา 2 นาทีที่ 50 องศาเซลเซียสและ
ขยายเป็นเวลา 3 นาที (10 นาทีในรอบสุดท้าย) ที่ 72 ° ซี ดีเอ็นเอ
เศษแคลิฟอร์เนีย 1.2 กิโลไบต์ในขนาดที่ถูกขยายโดยที่ซ้อนกัน-PCR
(รูปที่. 2) จากสารสกัดดีเอ็นเอของใบที่มีอาการจาก
พืชที่ติดเชื้อ แต่ไม่ได้มาจากดีเอ็นเอของใบมีสุขภาพดี
ที่ซ้อนกัน-PCR ซ้ำสามครั้งโดยใช้ตัวอย่างเดียวกัน
ดีเอ็นเอถูกเจลบริสุทธิ์โดยใช้ชุดการสกัดเจล
(Qiagen, นิวเดลี, อินเดีย) และโคลนในพลาสมิด (pGEMT®
vector- Promega) พลาสมิด DNAwas ติดใจโดยตรงใน
การหมุนทั้งที่ SciGenom Labs Pvt Ltd, เกรละอินเดียและต่อมา 1179 bp ลำดับถูกจัดชิดกับ
ClustalW (ธ อมป์สัน et al. 1994) โปรแกรม BLAST NCBI
ถูกใช้ในการสแกนข้อมูลลำดับกับ phytoplasma อื่น ๆ
16S rRNA ลำดับยีน phylogenetic ต้นไม้ที่ถูก
สร้างขึ้นโดยวิธีการเข้าร่วมเพื่อนบ้านโดยใช้
ซอฟต์แวร์รุ่น MEGA 5 (Saitou และ Nei 1987; ทามูระ
. et al, 2011)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างใบรวบรวมจากสี่อาการพืช
ของข้าวพันธุ์ ADT 43 , CO และสีขาว PONNI
( รวบรวมจากฟาร์ม tnau Coimbatore District ) และบีพีที
1 ( จากตำบลชะ ) และใช้ในการศึกษาปัจจุบัน เป็นวิธี ctab
ดัดแปลง ( warokka et al . 2549 ) ถูกใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอทั้งหมด
จากตัวอย่างใบข้าวเพื่อตรวจหา
phytoplasmas .วิธีซ้อน ) กับสากลคู่ไพรเมอร์
P1 / p7 ตามสากล ไพรเมอร์คู่ r16f2 / R2
ออกแบบเพื่อขยายส่วนของ 16S rRNA ยีน ( ลี et al .
1993 ; กันเดอร์เซน และ ลี ปี 1996 ) งาน หนึ่ง
ไมโครลิตรของดีเอ็นเอถูกใช้เพื่อขยายรอบแรกกับ
primer คู่ P1 / p7 และ 0.5 μ l สินค้ารอบแรกที่ถูกใช้เป็น
แม่แบบในที่ซ้อนกันโดยไม่ต้องเจือจางกับเชื้อไฟโตพลาสมา PCR ไพรเมอร์
เฉพาะ r16f2n / r16r2 . ทั้งหมด 35 ความร้อนรอบ
ทดลองซึ่งรวมถึง ( 1 นาที 2 นาที
สำหรับรอบแรก ) ที่ 94 ° C , อบอ่อนสำหรับ 2 นาทีที่ 50 ° C
ส่งเสริม 3 นาที ( 10 นาทีในรอบสุดท้าย ) ที่ 72 องศา ประมาณ 1.2 กิโลเบสในดีเอ็นเอ
ขนาดกำลังขยายโดยวิธี PCR
( รูปซ้อนกัน2 ) สารสกัดจากใบที่มีดีเอ็นเอจาก
พืชที่ติดเชื้อแต่ไม่ใช่จากดีเอ็นเอของใบที่มีสุขภาพดี
ซ้อนกัน 3 ครั้ง โดยใช้ตัวอย่างเดียวกัน
ดีเอ็นเอเป็นเจลบริสุทธิ์ใช้เจลสกัดชุด
( เพิ่ม , นิวเดลี , อินเดีย ) และโคลนในพลาสมิด ( pgemt ®
เวกเตอร์ -- promega ) การ dnawas พลาสมิดโดยตรงในทิศทางที่ทั้งสองนี้
scigenom Labs Pvt Ltd , เกรละอินเดียและต่อมามัน BP ของลำดับ ชิดกับ
clustalw ( Thompson et al . 1994 ) การ ncbi โปรแกรมระเบิด
ใช้สแกนข้อมูลลำดับเบส 16S rRNA ยีน
กับเชื้อไฟโตพลาสมาอื่น ๆดังนี้ phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างโดยเพื่อนบ้าน

ร่วมโดยใช้ซอฟต์แวร์รุ่นเมกะ 5 ( ไซโตะกับเนย 1987 ; ทามูระ
et al . 2011 )