2.3. cDNA microarraysNylon microarr

2.3. cDNA microarrays
Nylon microarrays were obtained from INRA-GADIE biological resources
centre (http://www-crb.jouy.inra.fr/) (Jouy-en-Josas, France) containing 9023
rainbow trout cDNAs originating from a pooled-tissue library (Govoroun et al.,
2006) spotted after PCR amplification. PCR products were spotted onto Hybond
N+ membranes as previously described (Nguyen et al., 1995). One hundred
twenty eight positive (luciferase) and 64 negative (water) controls were also
spotted on each microarray.
2.4. Hybridisation, scanning and quantifications of microarrays
Restricted to the trout cDNA microarray availability, only 3 hepatic RNA
samples originating from the two dietary groups were used for hybridisation at
INRA UMR1067 transcriptomic facility (St-Pée-sur-Nivelle, France) according
to the following procedure. RNA quality was determined using an Agilent
bioanalyser. The first hybridisation was performed at 42 °C for 48 h using γ33Plabelled
T7 promoter oligonucleotide (5'-CACTATAGGGAATTTGGCC-3') to
estimate the amount of cDNA in each spot. After stripping (3 h 68 °C, 0.1× SSC,
0.2% SDS), hybridisations with hepatic cDNAs were performed. Microarrays
were prehybridised for 1 h at 65 °C in hybridisation buffer (5× Denhardt,
5× SSC, 0.5% SDS). Labelled cDNAs were prepared from 5 μg of RNA by
simultaneous reverse transcription and labelling for 1 h at 42 °C in the presence
of 50 μCi [alpha-33P] dCTP, 5 μM dCTP and 800 μM each dATP. dGTP and
dTTP and 200 units SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) in 30 μl final volume. RNA was degraded by treatment at
68 °C for 30 min with 1 μl 10% SDS, 1 μl 0.5 M EDTA and 3 μl 3 M NaOH and
then equilibrated at room temperature for 15 min. Neutralization was done by
adding 1 μl 1 M Tris–HCl plus 3 μl 2 N HCl. Microarrays were then incubated

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 microarrays cDNA
microarrays ไนล่อนที่ได้รับจากทรัพยากรชีวภาพ INRA-gadie
ศูนย์ (http://www-crb.jouy.inra.fr/) (Jouy-en-Josas, ฝรั่งเศส) ที่มี 9,023
cDNAs เรนโบว์เทราท์ที่มาจากห้องสมุดเนื้อเยื่อ pooled (Govoroun et al.,
2006) พบหลังจากที่ขยาย PCR ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นด่างบน Hybond
N + เยื่อตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (เหงียน et al., 1995) หนึ่งร้อย
ยี่สิบแปดบวก (luciferase) และ 64 ลบ (น้ำ) การควบคุมนอกจากนี้ยัง
พบในแต่ละ microarray.
2.4 hybridisation สแกนและ quantifications ของ microarrays
ชมได้ cDNA ปลาเทราท์ว่าง microarray เพียง 3 อาร์เอ็นเอตับ
ตัวอย่างที่มาจากทั้งสองกลุ่มอาหารที่ถูกนำมาใช้สำหรับ hybridisation ที่
INRA UMR1067 transcriptomic สิ่งอำนวยความสะดวก (St-Pée-sur-เวลล์, ฝรั่งเศส) ตาม
ต่อไปนี้ ขั้นตอน อาร์เอ็นเอที่มีคุณภาพได้รับการพิจารณาโดยใช้ Agilent
bioanalyser hybridisation แรกได้ดำเนินการที่ 42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงโดยใช้γ33Plabelled
oligonucleotide โปรโมเตอร์ T7 (5'-CACTATAGGGAATTTGGCC-3 ') เพื่อ
ประเมินปริมาณของยีนในแต่ละจุด หลังจากปอก (3 ชั่วโมง 68 ° C 0.1 × SSC,
0.2% SDS) hybridisations cDNAs กับตับได้ดำเนินการ microarrays
ถูก prehybridised เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 65 องศาเซลเซียสในบัฟเฟอร์ hybridisation (5 × Denhardt,
5 × SSC, 0.5% SDS) cDNAs ป้ายที่เตรียมจาก 5 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอโดย
ถอดความกลับพร้อมกันและการติดฉลากเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 42 องศาเซลเซียสในการปรากฏตัว
ของ 50 μCi [alpha-33p] dCTP 5 ไมครอน dCTP และ 800 ไมครอนแต่ละ dATP dGTP และ
dTTP และ 200 หน่วยยก™ III กลับ Transcriptase (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) ใน 30 เล่มสุดท้ายไมโครลิตร อาร์เอ็นเอที่ถูกสลายตัวโดยการรักษาที่
68 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีกับ 1 ไมโครลิตร 10% SDS 1 ไมโครลิตร 0.5 M EDTA และ 3 ไมโครลิตร 3 M NaOH และ
equilibrated แล้วที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที การวางตัวเป็นกลางทำโดย
การเพิ่ม 1 ไมโครลิตร 1 M Tris-HCl บวก 3 ไมโครลิตร 2 HCl microarrays ถูกบ่มแล้ว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 ิิ cDNA
ไนล่อนได้จากศูนย์ทรัพยากรชีวภาพ inra-gadie
( http://www-crb.jouy.inra.fr/ ) ( jouy en josas , ฝรั่งเศส ) ที่มี 9023
ปลาเรนโบว์เทราท์ cdnas เกิดจากเนื้อเยื่อรวมห้องสมุด ( govoroun et al . ,
2006 ) ด่าง ( หลัง ) . ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกพบบน hybond
n + ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Nguyen et al . , 1995 ) 100
ยี่สิบแปดบวก ( ลูซิเฟอเรส ) และ 64 ลบ ( น้ำ ) การควบคุมยังเห็นแต่ละ microarray
.
2.4 . ไฮบริไดเซชัน การสแกน และ quantifications ของการแสดง
จำกัดปลาเทราท์ cDNA microarray ว่างเพียง 3 ตัวอย่าง RNA
ตับที่เกิดจากสองอาหารกลุ่มนำมาไฮบริไดเซชันที่ทีมนักวิจัยของ umr1067
transcriptomic สิ่งอำนวยความสะดวก ( st-p é e-sur-nivelle , ฝรั่งเศส ) ตาม
ในขั้นตอนต่อไปนี้ คุณภาพของอาร์เอ็นเอ ตั้งใจใช้เลนต์
bioanalyser . ส่วนแรกทำการไฮบริไดเซชันที่อุณหภูมิ 42 องศา C 48 H ใช้γ 33plabelled
* * 3 ซึ่งผู้ก่อการ ( 5 ' - cactatagggaatttggcc-3 ' )
ประมาณการปริมาณของยีนในแต่ละจุด หลังจากลอก ( 3 ) 68 ° C 0.1 × SSC
0.2% SDS ) hybridisations กับตับ cdnas การวิจัย ิ
เป็น prehybridised เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 65 องศา C ในบัฟเฟอร์ไฮบริไดเซชัน ( 5 × denhardt
5 × , SSC , 0.5 % SDS ) ป้าย cdnas เตรียมตั้งแต่ 5 μกรัมของ RNA โดย
ถอดความย้อนกลับพร้อมกันและการติดฉลาก 1 H ที่ 42 ° C ในการปรากฏตัว
50 μ CI [ alpha-33p ] dctp dctp 5 , 800 μμ M แต่ละ datp . dgtp และ
dttp 200 หน่วยตัวยก™ III reverse transcriptase ( Invitrogen
, Carlsbad , CA ,ประเทศสหรัฐอเมริกา ) ใน 30 μ L สุดท้ายเสียง ซึ่งเกิดขึ้นโดยการรักษาที่
68 ° C เป็นเวลา 30 นาที กับ 1 μผม 10% SDS , 1 μ L 0.5 M EDTA และ 3 μ L 3 M NaOH และ
แล้ว equilibrated ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที การวางตัวเป็นกลางโดย
เพิ่ม 1 μ L 1 M โดย– HCl บวก 3 μ L 2 N HCL . ิแล้ว )