Protein extraction and Western blot

Protein extraction and Western blot analyses
Whole-cell lysates were prepared in RIPA buffer and nuclear
extracts were prepared as previously described [15] with slight
modifications [16]. In brief, nuclear pellets were resuspended in
3 mL of 0.25 M sucrose containing 10 mM MgCl2, layered over
with 3 mL cushion of 0.35 M sucrose containing 0.5 mM MgCl2
and centrifuged at 1400g for 5 min at 4 °C. The resulting nuclear
pellets were resuspended in ice-cold buffer containing 20 mM
HEPES pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM each of DTT, EDTA, EGTA and
PMSF, placed on a rotatory shaker for 15 min followed by centrifugation
at 14,000 rpm for 10 min.
Aliquots of the protein extracts were subjected to the western
blot analysis (whole cell extracts in RIPA buffer) or separated by
SDS-PAGE (10% T; BioRad mini protean III cell; BioRad Laboratories
GmbH, München, Germany) for further in-gel digestion (nuclearenriched
extracts). Western blot analysis was performed using
following primary antibodies: phospho-specific (Ser139) and total
histone H2AX (Cell signaling Technology) and β-actin (BD Biosciences).
Secondary antibodies were obtained from Jackson ImmunoResearch
(West Grove, PA). Total and phosphorylated histone
H2AX levels were normalized to β-actin. Western blots were developed
using chemiluminescence detection and analyzed by
densitometry

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรตีนสกัดและตะวันตกทำลายวิเคราะห์Lysates เซลล์ทั้งหมดได้ถูกเตรียมไว้ในบัฟเฟอร์ริป้าราคา และนิวเคลียร์สารสกัดเตรียมไว้เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย [15] ด้วยเล็กน้อยแก้ไข [16] สังเขป ขี้นิวเคลียร์ถูก resuspended ในชั้น 3 mL ของซูโครส 0.25 M ประกอบด้วย 10 มม. MgCl2 เหนือมีเบาะ 3 mL ของซูโครส 0.35 M ประกอบด้วย MgCl2 0.5 mMและ centrifuged ที่ 1400g ใน 5 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส การเกิดนิวเคลียร์ขี้ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ฉ่ำประกอบด้วย 20 มม.HEPES pH 7.9, 400 มม. NaCl, 1 mM DTT, EDTA, EGTA และเชคเกอร์ rotatory สำหรับ 15 นาทีตาม ด้วย centrifugation PMSF วางที่ 14000 รอบต่อนาทีใน 10 นาทีAliquots สารสกัดจากโปรตีนถูกต้องตะวันตกวิเคราะห์ (แยกเซลล์ทั้งหมดในริป้าราคาบัฟเฟอร์) ทำลาย หรือคั่นด้วยหน้าองค์กร (10% T BioRad มินิ protean III เซลล์ ห้องปฏิบัติการ BioRadGmbH โฮเต็ลมันเช็น เยอรมนี) สำหรับเพิ่มเติมในเจย่อยอาหาร (nuclearenrichedสารสกัด) วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาถูกดำเนินการโดยใช้ต่อแอนตี้หลัก: phospho-เฉพาะ (Ser139) และผลรวมฮิสโตน H2AX (เซลล์ตามปกติเทคโนโลยี) และβ-แอกติน (เวลาออก BD)แอนตี้รองได้รับมาจาก Jackson ImmunoResearch(เวสต์โกรฟ PA) รวม และ phosphorylated ฮิสโตนระดับ H2AX ได้ตามปกติให้β-แอกติน กันบล็อทตะวันตกได้รับการพัฒนาใช้ chemiluminescence ตรวจ และวิเคราะห์โดยdensitometry

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดโปรตีนและดวงตะวันวิเคราะห์
lysates เซลล์ทั้งได้จัดทำขึ้น RIPA buffer
นิวเคลียร์และสารสกัดได้จัดทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[15]
เล็กน้อยกับการปรับเปลี่ยน[16] ในช่วงสั้น ๆ เม็ดนิวเคลียร์ถูก resuspended ใน
3 มิลลิลิตร 0.25 M ที่มีน้ำตาลซูโครส 10 มิลลิ MgCl2, ชั้นมากกว่า
3 มิลลิลิตรเบาะ 0.35 M ที่มีน้ำตาลซูโครส 0.5 มิลลิ MgCl2
และหมุนเหวี่ยงที่ 1400g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C ผลนิวเคลียร์เม็ดถูก resuspended ในเย็นบัฟเฟอร์ที่มี 20 มิลลิ HEPES พีเอช 7.9, 400 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 1 มิลลิแต่ละ DTT, EDTA, EGTA และPMSF วางไว้บนเครื่องปั่นหมุนเวียนเป็นเวลา 15 นาทีตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 . นาที aliquots ของสารสกัดจากโปรตีนที่ถูกยัดเยียดให้ตะวันตกวิเคราะห์เปื้อน(สารสกัดจากเซลล์ทั้งในบัฟเฟอร์ RIPA) หรือแยกจากกันโดยSDS-PAGE (10% T; BioRad มินิ Protean III เซลล์ BioRad ห้องปฏิบัติการGmbH, มิวนิค, เยอรมนี) สำหรับต่อไปใน การย่อยอาหารเจล (nuclearenriched สารสกัด) การวิเคราะห์ดวงตะวันได้รับการดำเนินการโดยใช้ต่อไปนี้แอนติบอดีหลัก phospho เฉพาะ (Ser139) และรวม. H2AX สโตน (มือถือเทคโนโลยีการส่งสัญญาณ) และβ-โปรตีน (BD ชีววิทยาศาสตร์) แอนติบอดีมัธยมศึกษาที่ได้รับจากแจ็คสัน ImmunoResearch (เวสโกรฟ, PA) รวม phosphorylated สโตนระดับH2AX ปกติจะถูกเบต้าโปรตีน blots ตะวันตกได้รับการพัฒนาโดยใช้การตรวจสอบchemiluminescence และวิเคราะห์โดยความหนาแน่น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดโปรตีนและวิเคราะห์
Western blot lysates ทั้งเซลล์ที่ถูกเตรียมไว้ในบัฟเฟอร์ RIPA และนิวเคลียร์
สารสกัดที่เตรียมไว้ [ 15 ] ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยก่อนหน้านี้
[ 16 ] ในช่วงสั้น ๆ , นิวเคลียร์ resuspended ในอัตรา 0.25 m
3 ml ซูโครสประกอบด้วยชุด 10 มม. ชั้นกว่า
3 ml เบาะ 0.35 M ซูโครส 0.5 มม. ประกอบด้วย
ชุดไฟฟ้าที่ 1400g สำหรับ 5 นาทีที่ 4 องศาส่งผลให้อัตรา resuspended นิวเคลียร์
ในบัฟเฟอร์ที่มีน้ำแข็งเย็น 20 mm
ฮีเปส pH 9 , 400 มม. ขนาด 1 มม. แต่ละส่วนหน่วย
PMSF และ EDTA , วางไว้บนเครื่องปั่นซึ่งทำให้หมุนรอบ 15 นาทีตามด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที

เฉยๆของโปรตีนที่แยกได้ถูกกับตะวันตก
blot การวิเคราะห์ ( ทั้งเซลล์สารสกัด RIPA บัฟเฟอร์ ) หรือคั่นด้วย
SDS-PAGE ( 10 % t ;เซลล์ biorad Mini ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก 3 ; biorad ห้องปฏิบัติการ
GmbH , M ü nchen , เยอรมนี ) สำหรับเพิ่มเติมในการย่อยอาหาร ( nuclearenriched
เจลสารสกัด ) การวิเคราะห์ Western blot แสดงโดยใช้
ต่อไปนี้แอนติบอดีหลัก : phospho เฉพาะ ( ser139 ) และ h2ax หมอกแดดรวม
( สัญญาณมือถือเทคโนโลยี ) และบีตา - actin ( BD BIOSCIENCES ( มัธยมศึกษา )

( ได้จาก แจ็คสัน immunoresearch ป่าตะวันตกป่า )รวมและฟอสฟอรีเลเตตระดับ h2ax หมอกแดด
เป็นปกติกับบีตา - actin . blots ตะวันตกถูกพัฒนาโดยใช้การตรวจหาและวิเคราะห์ด้วย

densitometry เคมีลูมิเนสเซน