5.6.2. Sample preparation for detec

5.6.2. Sample preparation for detecting release of mitochondrial
proteins
The cells are seeded as described in Section 5.2.1. The concentration
of digitonin and the required lysis period has to be optimized
for each cell type. Serial concentrations of digitonin (e.g.
0.01, 0.015, 0.02, 0.025 and 0.03) should be tested to select the condition
in which the outer membrane is permeabilized (detection of
cytosolic proteins such as actin), while the mitochondrial or
lysosomal membranes remain intact [6]. After centrifuging for
5 min at 250g and removing PBS, the cells are lysed in 100 ll of
0.02% digitonin dissolved in CFS buffer and left on ice for 1 min
to stop biochemical activity. Then the lysate is centrifuged for
10 min at 20,800g (4 C) and the cytosol is transferred to an Eppendorf
tube. One-fifth volume of 5 Laemmli buffer is added to the
cytosolic lysate and 100 ll 1 Laemmli buffer to the remaining
organelle fraction. The samples are boiled for 5–10 min and equal
volumes of the organelle fraction or cytosolic cell lysate are loaded
per lane on 12.5% SDS–polyacrylamide gels. After electroblotting
the proteins to a nitrocellulose membrane, Bid cleavage and mitochondrial
proteins such as cytochrome c, HTRA2/Omi, AIF and
Endonuclease G are detected with appropriate antibodies. Reveal
the signal with, e.g. Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer
Life Sciences, Boston, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5.6.2 ตัวอย่างการเตรียมสำหรับการตรวจสอบรุ่นของ mitochondrialโปรตีนเซลล์มี seeded ตามที่อธิบายไว้ในหัวข้อ 5.2.1 ความเข้มข้นdigitonin และระยะ lysis ต้องมีการปรับให้เหมาะสำหรับแต่ละชนิดของเซลล์ ลำดับความเข้มข้นของ digitonin (เช่น0.01, 0.015, 0.02, 0.025 และ 0.03) ควรจะทดสอบเพื่อเลือกเงื่อนไขที่เยื่อหุ้มภายนอกเป็น permeabilized (ตรวจcytosolic โปรตีนเช่นแอกติน), ในขณะที่ mitochondrial หรือเยื่อหุ้ม lysosomal ยังคง เหมือนเดิม [6] หลังจาก centrifuging สำหรับ5 นาทีที่ 250g และเอา PBS, lysed เซลล์ใน 100 จะของdigitonin 0.02% ละลายในบัฟเฟอร์ CFS และทิ้งน้ำแข็งใน 1 นาทีหยุดกิจกรรมชีวเคมี แล้ว ที่ lysate มี centrifuged สำหรับ10 นาที 20,800g (4 C) และไซโตซอลถูกโอนย้ายไป Eppendorfหลอด เพิ่มปริมาณหนึ่งห้า 5 Laemmli บัฟเฟอร์cytosolic lysate และ 100 ll 1 Laemmli บัฟเฟอร์เหลือออร์แกเนลล์เป็นเศษส่วน ตัวอย่างถูกต้มใน 5 – 10 นาที และเท่าปริมาณของเศษส่วนออร์แกเนลล์หรือเซลล์ lysate cytosolic โหลดต่อเลนบน SDS – polyacrylamide 12.5% หลังจาก electroblottingโปรตีนจะเป็น nitrocellulose เมมเบรน ปริประมูล และ mitochondrialโปรตีนเช่น cytochrome c, HTRA2/โอะ, AIF และEndonuclease G พบกับแอนตี้ที่เหมาะสม เปิดเผยสัญญาณพร้อม เช่น Chemiluminescence รีเอเจนต์ (PerkinElmerวิทยาศาสตร์สุขภาพ บอสตัน สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5.6.2 การเตรียมตัวอย่างสำหรับการตรวจสอบการปล่อยของยล
โปรตีน
เซลล์จะเมล็ดตามที่อธิบายไว้ในมาตรา 5.2.1 ความเข้มข้น
ของ digitonin และระยะเวลาการสลายที่จำเป็นจะต้องมีการปรับให้เหมาะสม
สำหรับแต่ละเซลล์ชนิด ความเข้มข้นของอนุกรม digitonin (เช่น
0.01, 0.015, 0.02, 0.025 และ 0.03) ควรจะทดสอบเพื่อเลือกเงื่อนไข
ในการที่เยื่อหุ้มชั้นนอกเป็น permeabilized (การตรวจหา
โปรตีน cytosolic เช่นโปรตีน) ในขณะยลหรือ
เยื่อ lysosomal ยังคงเหมือนเดิม [6 ] หลังจากการปั่นแยกสำหรับ
5 นาทีที่ 250 กรัมและลบพีบีเอสเซลล์ lysed ใน 100 LL ของ
0.02% digitonin ละลายในบัฟเฟอร์ CFS และซ้ายบนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 นาที
ที่จะหยุดกิจกรรมทางชีวเคมี จากนั้น lysate ปั่นสำหรับ
10 นาทีที่ 20,800g (4 องศาเซลเซียส) และเซลล์จะถูกโอนไป Eppendorf
หลอด ปริมาณหนึ่งในห้าของ 5? บัฟเฟอร์ Laemmli จะถูกเพิ่ม
lysate cytosolic และ 100 LL 1? บัฟเฟอร์ Laemmli ไปส่วนที่เหลืออีก
ส่วนเนลล์ ตัวอย่างต้มประมาณ 5-10 นาทีและเท่ากับ
ปริมาณของส่วน organelle หรือ lysate เซลล์ cytosolic มีการโหลด
ต่อเลน 12.5% ​​เจล SDS-polyacrylamide หลังจาก electroblotting
โปรตีนเยื่อ nitrocellulose แตกแยกประมูลและยล
โปรตีนเช่น cytochrome C, HTRA2 / ลางร้าย, AIF และ
Endonuclease G มีการตรวจพบแอนติบอดีที่มีความเหมาะสม เปิดเผย
สัญญาณด้วยเช่น Chemiluminescence Reagent พลัส (PerkinElmer
วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต, บอสตัน, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5.6.2 . ตัวอย่างการเตรียมการปลดปล่อยโปรตีนยล

เซลล์เมล็ดตามที่อธิบายไว้ในส่วน 5.2.1 . ความเข้มข้นของดิจิโทนินและต้องการสลาย

สำหรับระยะเวลาที่จะปรับเซลล์แต่ละชนิด อนุกรมความเข้มข้นของดิจิโทนิน ( เช่น
0.01 , 0.015 , 0.02 , 0.025 และ 0.03 ) ควรมีการทดสอบเพื่อเลือกเงื่อนไข
ซึ่งในเนื้อเยื่อชั้นนอกเป็น permeabilized ( การตรวจหาโปรตีน cytosolic
เช่น actin ) ขณะตัดหรือ
lysosomal เยื่อยังคงเหมือนเดิม [ 6 ] หลังจากสารสำหรับ
5 นาที 250 และการลบพีบีเอส เซลล์จะ lysed 100 จะ
0.02 % ดิจิโทนินละลาย CFS บัฟเฟอร์ และซ้ายบนน้ำแข็ง 1 นาที
หยุดกิจกรรมทางชีวเคมี แล้ว lysate เป็นระดับสำหรับ
10 นาทีที่ 20800 g ( 4  C ) และเข็มทิศก็ย้ายไปเป็นหลอดเพนดอร์ฟ

เล่ม 5 5  laemmli บัฟเพิ่ม
lysate cytosolic และ 100 จะ 1  laemmli บัฟเฟอร์ที่จะเหลือ
ออร์แกเนลล์เศษส่วน ตัวอย่างต้ม 5 – 10 นาทีและปริมาณเท่ากัน
ของออร์แกเนลล์เซลล์ cytosolic เศษส่วนหรือ lysate โหลด
ต่อถนน 12.5% SDS polyacrylamide เจล ) . หลังจาก electroblotting
โปรตีนเป็นไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน , แตกแยกเสนอราคาและยล
โปรตีน เช่น ไซโตโครม ซี htra2 / โอมิ AIF , และตรวจพบแอนติบอดีต่อ
เอนโดนิวคลีเอสกับเหมาะสม เปิดเผย
สัญญาณด้วย เช่น นโยบายแรงงาน 3 พลัส ( Perkinelmer
ชีวิตวิทยาศาสตร์ , Boston , USA )