V. fischeri JB10 was grown in marin

V. fischeri JB10 was grown in marine broth to exponential phase and then transferred (1%) to a defined minimal medium (Studer et al., 2008). Cultures were grown at 28°C and 200 rpm in 250 mL shake flasks with a working volume of 50 mL for 8 h. Treatments were added at 8 h and exposure/growth continued for 4 h. At 12 h of total growth, 2 mL of cells were harvested by centrifugation at 2000 × g (5 min). Cells were treated with 2 mg/mL lysozyme in TE buffer for 10 minutes and then homogenized with a needle and syringe. RNA was extracted with PureLink RNA Mini Kit (Ambion) and on-column DNA digestion was performed with PureLink PCR Micro Kit (Invitrogen). qPCR was performed on a BioRad CFX96 Real Time System with a C1000 Thermal Cycler. Data was analyzed by the Livak method (ΔΔCt) and fold changes were determined by using 2−ΔΔCt.

Primers were designed for luxR and luxA with NCBI's Primer-BLAST. Primer sequences for luxA were ATCCCCATCTTCGTGAACGG and ACAGAACATGGCCACGACAT. Primer sequences for luxR were CGTGGGCGAGTGAAGGAAAA and TGGCGCCAGTTAAAATTGCT. Primer sequences for the 16S rRNA gene were GTTTGATCATGGCTCAGATTG and CTACCTTGTTACGACTTCACC (Hoffmann et al., 2010). The 16S rRNA gene was used as the reference gene. All primers were ordered from Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). Genomic DNA from V. fischeri JB10 was amplified with the primers and sequenced by Selah Genomics (Columbia, SC) to check the accuracy of the primers.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

V. fischeri JB10 ปลูกในซุปทะเลระยะเนน และโอนย้าย (1%) แล้ว กำหนดน้อยปานกลาง (Studer et al., 2008) วัฒนธรรมถูกปลูกที่ 28° C และ 200 รอบต่อนาทีในน้ำปั่น 250 mL ด้วยทำ 50 mL รักษา 8 h. เพิ่ม 8 h และแสงการเติบโตอย่างต่อเนื่องสำหรับ 4 h ที่ h 12 รวมโต 2 mL ของเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 2000 × g (5 นาที) เซลล์ได้รับ lysozyme 2 mg/mL ในบัฟเฟอร์ TE 10 นาที ก homogenized เป็นกลุ่มแล้ว มีเข็มและเข็ม อาร์เอ็นเอที่สกัด ด้วยชุดมินิอาร์เอ็นเอ PureLink (Ambion) และทำการย่อยอาหารดีเอ็นเอในคอลัมน์ ด้วยชุดไมโคร PCR PureLink (Invitrogen) qPCR ที่ดำเนินการในระบบ Real Time CFX96 BioRad ด้วยเป็น C1000 ร้อน Cycler ข้อมูลที่วิเคราะห์ โดยวิธี Livak (ΔΔCt) และพับเปลี่ยนแปลงถูกกำหนดโดย 2−ΔΔCtไพรเมอร์ถูกออกแบบสำหรับ luxR และ luxA กับพื้นระเบิดของ NCBI ลำดับรองพื้นสำหรับ luxA ได้ ATCCCCATCTTCGTGAACGG และ ACAGAACATGGCCACGACAT ลำดับรองพื้นสำหรับ luxR ได้ CGTGGGCGAGTGAAGGAAAA และ TGGCGCCAGTTAAAATTGCT ลำดับรองพื้นสำหรับการ 16S rRNA ยีนได้ GTTTGATCATGGCTCAGATTG และ CTACCTTGTTACGACTTCACC (Hoffmann et al., 2010) มีใช้ 16S rRNA ยีนเป็นยีนอ้างอิง ไพรเมอร์ทั้งหมดที่สั่งจากดีเอ็นเอเทคโนโลยี (Coralville รัฐไอโอวา) Genomic DNA จาก V. fischeri JB10 ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ที่ และเรียงลำดับตาม Selah Genomics (โคลัมเบีย SC) เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของไพรเมอร์ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โวลต์ fischeri JB10 ถูกปลูกในน้ำซุปทะเลเพื่อชี้แจงขั้นตอนและโอนแล้ว (1%) ที่จะเป็นสื่อกลางที่กำหนดไว้ที่น้อยที่สุด (Studer et al., 2008) วัฒนธรรมปลูกวันที่ 28 ° C และ 200 รอบต่อนาที 250 มิลลิลิตรขวดสั่นที่มีปริมาณการทำงานของ 50 มลเป็นเวลา 8 ชั่วโมง การรักษาที่ถูกเพิ่ม 8 ชั่วโมงและการสัมผัส / การเจริญเติบโตอย่างต่อเนื่อง 4 ชั่วโมง ใน 12 ชั่วโมงของการเจริญเติบโตรวม 2 มิลลิลิตรของเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 ×กรัม (5 นาที) เซลล์ได้รับการรักษาด้วย 2 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรไลโซไซม์ในบัฟเฟอร์ TE เป็นเวลา 10 นาทีและปั่นแล้วด้วยเข็มและเข็มฉีดยา อาร์เอ็นเอถูกสกัดด้วยมินิอาร์เอ็นเอ PureLink Kit (Ambion) และการย่อยอาหารดีเอ็นเอในคอลัมน์ได้ดำเนินการกับ PureLink PCR ไมโคร Kit (Invitrogen) qPCR ได้ดำเนินการใน BioRad CFX96 ระบบแบบ Real Time ด้วยความร้อน C1000 Cycler วิเคราะห์ข้อมูลโดยวิธี Livak (ΔΔCt) และการเปลี่ยนแปลงพับได้รับการพิจารณาโดยใช้ 2 ΔΔCt. ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบสำหรับ luxR และ LUXA กับ NCBI ของรองพื้น-ระเบิด ลำดับไพรเมอร์สำหรับ LUXA มี ATCCCCATCTTCGTGAACGG และ ACAGAACATGGCCACGACAT ลำดับไพรเมอร์สำหรับ luxR เป็น CGTGGGCGAGTGAAGGAAAA และ TGGCGCCAGTTAAAATTGCT ลำดับไพรเมอร์สำหรับ 16S rRNA ยีนเป็น GTTTGATCATGGCTCAGATTG และ CTACCTTGTTACGACTTCACC (Hoffmann et al., 2010) 16S rRNA ยีนถูกใช้เป็นยีนอ้างอิง ไพรเมอร์ทุกคนได้รับคำสั่งจากเทคโนโลยีดีเอ็นเอแบบบูรณาการ (คอรัลวิลล์, ไอโอวา) ดีเอ็นเอจากโวลต์ fischeri JB10 ถูกขยายด้วยไพรเมอร์และเซลาห์ติดใจโดยฟังก์ชั่น (โคลัมเบีย) เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของไพรเมอร์ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โวลต์ fischeri jb10 ปลูกในน้ำซุปทะเลกับระยะ exponential และโอน ( 1 ) การกำหนดสื่อน้อยที่สุด ( studer et al . , 2008 ) วัฒนธรรมที่ปลูกที่ 28 ° C และความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีใน 250 ml . ขวดเขย่ากับการทำงานปริมาตร 50 มิลลิลิตร เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การรักษาที่ถูกเพิ่มใน 8 ชั่วโมง และการสัมผัส / การเจริญเติบโตอย่างต่อเนื่องสำหรับ 4 ชั่วโมง ใน 12 ชั่วโมง ของการรวม2 ml ของเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่× 2000 กรัม ( 5 นาที ) เซลล์มีการรักษาด้วย 2 มก. / มล. และไลโซไซม์ใน TE buffer นาน 10 นาที แล้วบดกับเข็มและหลอดฉีดยา สกัด RNA ด้วยชุดมินิ purelink RNA ( ambion ) และการย่อย DNA PCR ไมโครคอลัมน์ใช้ purelink Kit ( Invitrogen )qpcr แสดงบน biorad cfx96 เวลาจริงกับระบบ c1000 Thermal cycler . วิเคราะห์ข้อมูลโดยวิธี livak ( ΔΔ CT ) และพับการวิเคราะห์โดยใช้ไพรเมอร์ 2 −ΔΔ CT .

ถูกออกแบบมาสำหรับ luxr luxa กับรองพื้นและ ncbi เป็นระเบิด รองพื้นลำดับสำหรับ luxa และมี atccccatcttcgtgaacgg acagaacatggccacgacat .รองพื้นลำดับสำหรับ luxr และมี cgtgggcgagtgaaggaaaa tggcgccagttaaaattgct . รองพื้นลำดับเบส 16S rRNA ยีนเพื่ออยู่และ gtttgatcatggctcagattg ctaccttgttacgacttcacc ( Hoffmann et al . , 2010 ) ส่วนเบส 16S rRNA ยีนที่ใช้ในการอ้างอิงของยีน ทั้งหมดโดยสั่งจากดีเอ็นเอเทคโนโลยีแบบบูรณาการ ( คอรัลวิลล์ , ไอโอวา ) ดีเอ็นเอจาก Vfischeri jb10 ถูกขยายด้วยชนิดนี้ โดยเซลาห์ไร ( SC โคลัมเบีย ) เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของรองพื้น