3. Results3.1. Selection of target

3. Results
3.1. Selection of target genes to detect and differentiate Legionella
species
A total of 125 candidate target genes involved in the bacterial
protein secretion system (n ¼ 28), flagellar biosynthesis (n ¼ 25),
and LPS biosynthesis (n ¼ 6) and other known virulence factors
were screened in all 29 Legionella species by an in-house conventional
PCR assay. Among them, specific primer sets for three
candidate genes were found to independently detect and differentiate
Legionella species, L. pneumophila, and L. pneumophila sg1.
Three sets of primers targeted groES (specific to Legionella species),
xcpX (specific to L. pneumophila species), and rfbA (L. pneumophila
sg1-specific).
3.2. Development and optimization of the multiplex real-time PCR
First, a simplex real-time PCR assay was established. When the
melting curves of simplex real-time PCR were analyzed for each of
the 29 Legionella species tested, the positive amplification products
for groES, xcpX, and rfbA genes were detected at 83.59 ± 0.33
C,
79.07 ± 0.4
C, and 81
C, respectively. The efficiency of amplifi-
cation determined using L. pneumophila sg1 was 90.7%, 96.2%, and
S.M. Kim et al. / Molecular and Cellular Probes 29 (2015) 414e419 415
94.2% for the groES, xcpX, and rfbA genes, respectively. In order to
assess the specificity of each amplicon, we sequenced amplicons
from the groES, xcpX and rfbA genes for 29 Legionella species,
L. pneumophila sg1e15 and L. pneumophila sg1, respectively.
In the single-tube multiplex real-time PCR assay, three distinct
peaks were clearly visualized with L. pneumophila sg1, indicating
positivity for groES, xcpX, and rfbA genes. Each DNA sample from
L. pneumophila serogroups 2e15 showed two peaks compatible
with groES and xcpX, whereas non-pneumophila Legionella species
showed only one peak for groES (Fig. 1). L. pneumophila sg1 samples
showed three distinct peaks at 83.6
C for groES, 77.4
C for xcpX,
and 80.2
C for rfbA. The average melting temperature (Tm) for groES
primer set was 83.45 ± 0.31
C for all tested Legionella species, and
78.2 ± 0.35
C for xcpX in L. pneumophila sg1e15 (Table 1). We
observed a small difference in melting peaks in the assay for the
groES gene between three non-L. pneumophila species and the other
Legionella species assessed. The melting peaks for Legionella
jordanis (84.8
C) and Legionella rubrilucens (85.2
C) were higher
than for L. pneumophila sg1e15 (83.41 ± 0.14
C), whereas a relatively
low melting peak (82.6
C) was observed for Legionella
sainthelensi (Table 1). No specific peaks were detected for negative
control samples. The multiplex real-time PCR products for groES,
xcpX and rfbA genes by gel electrophoresis were confirmed the
expected 274 bp, 133 bp and 118 bp in size, respectively (results not
shown).
3.3. Specificity of the multiplex real-time PCR
The specificity of the primers was tested using 10 non-Legionella
bacteria. No amplification products were detected using any of the
non-Legionella bacteria (results not shown). These findings suggest
that this multiplex real-time PCR assay is specific for Legionella
species.
3.4. Analytical sensitivity and reproducibility of the multiplex realtime
PCR assay
The analytical sensitivity of the multiplex real-time PCR assay
was assessed using serial dilutions of bacterial cells of
L. pneumophila sg1. The LOD was 3.8  102 CFU in 36.05 cycles (SD,
0.253) (Supplementary Table 3). The amplification efficiency was
88% (Fig. 2A). For serial dilutions of DNA samples from
L. pneumophila sg1, the LOD value was 100 fg/mL (Supplementary
Table 3); high amplification efficiency was obtained (99.1%)
(Fig. 2B). To assess the reproducibility of the assay, serial ten-fold
dilutions of genomic DNA from L. pneumophila sg1 were tested in
the multiplex real-time PCR. The intra-assay variation (coefficient
of variation, CV) ranged from 0.45% to 1.68%, and the inter-assay
variability from 0.86% to 1.61%, demonstrating reproducibility of
results.
3.5. Validity of the multiplex real-time PCR assay in clinical samples
and Legionella isolates
To validate whether this assay could be used for the testing of
clinical specimens from patients with suspected Legionnaires'
disease, the multiplex real-time PCR assay was performed on stored
sputum samples from 10 patients with community-acquired
pneumonia who were positive for Legionella in bacterial culture,
IFA, or UAT. The testing of sputum samples from patients who had
isolates of L. pneumophila sg1 (n ¼ 5) or L. pneumophila serogroups
2e15 (n ¼ 1) revealed the expected melting peaks (Table 2). Of the
other four culture-negative sputum samples, two sputum samples
showed positive results for L. pneumophila sg1. All seven
L. pneumophila sg1-specific amplification products had an average
Tm of 83.43 ± 0.08
C for groES, 80.33 ± 0.09
C for xcpX, and
77.89 ± 0.24
C for rfbA. Two sputum samples from patients who
were posi

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1. การเลือกยีนเป้าหมายเพื่อตรวจสอบ และแยกแยะ Legionellaสายพันธุ์รวม 125 ผู้สมัครเป้าหมายยีนที่เกี่ยวข้องในแบคทีเรียระบบการหลั่งโปรตีน (n ¼ 28), flagellar สังเคราะห์ (n ¼ 25),และสังเคราะห์ LPS (¼ 6 n) และอื่น ๆ ที่รู้จักปัจจัยความรุนแรงคัดทั้งหมด 29 Legionella สายพันธุ์โดยในบ้านทั่วไปPCR assay ในหมู่พวกเขา รองพื้นเฉพาะชุดสามพบยีนผู้สมัครเพื่อตรวจสอบอย่างอิสระ และแยกความแตกต่างสายพันธุ์ Legionella, L. pneumophila และ L. pneumophila sg1สามชุดของไพรเมอร์เป้าหมาย groES (เฉพาะในสายพันธุ์ Legionella),xcpX (เฉพาะในสายพันธุ์ L. pneumophila), และ rfbA (L. pneumophilasg1 เฉพาะ)3.2. พัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพของการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์ PCRครั้งแรก การทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์ simplex ก่อ เมื่อการเส้นโค้งหลอมของ simplex แบบเรียลไทม์ PCR ถูกวิเคราะห์สำหรับแต่ละทดสอบสายพันธุ์ Legionella 29 ผลิตภัณฑ์ขยายบวกสำหรับ groES, xcpX และ rfbA ตรวจพบยีนที่ 83.59 ± 0.33 C79.07 ± 0.4 C และ 81 C ตามลำดับ ประสิทธิภาพของแอมพลิฟาย-รกที่ใช้ L. pneumophila sg1 เป็น 90.7%, 96.2% และเอสเอ็ม Kim et al./ โมเลกุล และเซลล์วัด 29 414e419 (2015) 41594.2% สำหรับ groES, xcpX และ ยีน rfbA ตามลำดับ เพื่อเป็นการประเมินความจำเพาะของแต่ละ amplicon เราเรียงลำดับ ampliconsจากยีน groES, xcpX และ rfbA สำหรับพันธุ์ Legionella 29L. pneumophila sg1e15 และ L. pneumophila sg1 ตามลำดับในหลอดเดียว multiplex แบบเรียลไทม์ PCR assay สามชั้นยอดได้แสดงเป็นภาพได้อย่างชัดเจนกับ L. pneumophila sg1 บ่งชี้บวกสำหรับ groES, xcpX และ rfbA ยีน แต่ละตัวอย่างดีเอ็นเอจากL. pneumophila serogroups 2e15 พบยอดสองเข้ากันได้มี groES และ xcpX ในขณะที่สายพันธุ์ Legionella pneumophila ปลอดพบสูงสุดเพียงหนึ่งสำหรับ groES (1 รูป) L. pneumophila sg1 ตัวอย่างแสดงให้เห็นยอดเขาที่แตกต่างกันสามที่ 83.6 C สำหรับ groES, 77.4 C สำหรับ xcpXและ C 80.2 สำหรับ rfbA ค่าเฉลี่ยที่หลอมละลายอุณหภูมิ (Tm) สำหรับ groESชุดรองพื้นแก้ไข 83.45 ± 0.31 C สำหรับทุกทดสอบพันธุ์ Legionella และ78.2 ± 0.35 C สำหรับ xcpX ใน L. pneumophila sg1e15 (ตารางที่ 1) เราสังเกตความแตกต่างเล็ก ๆ ละลายยอดทดสอบสำหรับการgroES ยีนระหว่างพันธุ์ปลอด L. pneumophila สามและอื่น ๆสายพันธุ์ Legionella ที่ประเมิน ยอดหลอมสำหรับ Legionellajordanis (84.8 C) และ Legionella rubrilucens (85.2 C) อยู่สูงกว่ากว่าสำหรับ L. pneumophila sg1e15 (83.41 ± 0.14 C), ในขณะค่อนข้างสูงสุดละลายต่ำ (82.6 C) พบว่า สำหรับ Legionellasainthelensi (ตาราง 1) พบยอดไม่เฉพาะสำหรับค่าลบควบคุมตัวอย่าง มัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์ PCR ผลิตภัณฑ์สำหรับ groESยีน xcpX และ rfbA โดยอิเจได้รับการยืนยันการคาดว่า 274 bp, 133 bp และ 118 bp ขนาด ตามลำดับ (ผลลัพธ์ไม่แสดง)3.3 ความจำเพาะของการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์ PCRทดสอบความจำเพาะของไพรเมอร์ที่ใช้ 10 Legionella ปลอดเชื้อแบคทีเรีย ใช้ใด ๆ ของผลิตภัณฑ์ขยายไม่พบการเชื้อแบคทีเรีย Legionella ปลอด (ไม่แสดงผล) ค้นพบเหล่านี้แนะนำว่า นี้ multiplex แบบเรียลไทม์ PCR assay จะเฉพาะเจาะจงสำหรับ Legionellaสายพันธุ์3.4. การวิเคราะห์ความไวและทำเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์PCR assayวิเคราะห์ความไวของการทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์ถูกประเมินว่าใช้เจือจาง serial ของเซลล์ของแบคทีเรียL. pneumophila sg1 ลอดการแก้ไข 3.8 102 CFU ในรอบ 36.05 (SD0.253) (เสริมตารางที่ 3) ประหยัดขยาย88% (รูป 2A) สำหรับเจือจาง serial ของตัวอย่างดีเอ็นเอจากL. pneumophila sg1 ค่า LOD ถูก 100 fg/mL (ตีนจกทางตารางที่ 3); ประสิทธิภาพสูงขยายมา (99.1%)(รูปที่ 2B) การประเมินทำ assay อนุกรม ten-foldเจือจางของดีเอ็นเอออกจาก L. pneumophila sg1 ทดสอบในการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์ PCR การเปลี่ยนแปลงระหว่างทดสอบ (ค่าสัมประสิทธิ์ของการเปลี่ยนแปลง CV) ตั้งแต่ 0.45% ถึง 1.68% และทดสอบระหว่างความแปรปรวนจาก 0.86% 1.61% สาธิตการทำผลลัพธ์ที่3.5. ความถูกต้องของการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์ PCR assay ในตัวอย่างทางการแพทย์และกั้น Legionellaเพื่อตรวจสอบว่าการทดสอบนี้สามารถใช้สำหรับการทดสอบทดสอบทางคลินิกจากผู้ป่วยที่สงสัยว่า Legionnairesโรค ทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์ทำการตามเก็บตัวอย่างเสมหะจากผู้ป่วย 10 ชุมชนที่ได้รับปอดบวมที่เป็นบวกสำหรับ Legionella ในแบคทีเรียวัฒนธรรมปรึกษาทางการเงิน หรือเอือด การทดสอบตัวอย่างเสมหะจากผู้ป่วยที่มีแยกของ L. pneumophila sg1 (n ¼ 5) หรือ L. pneumophila serogroups2e15 (¼ n 1) เปิดเผยคาดยอดเขาละลาย (ตารางที่ 2) ของการตัวอย่างอื่น ๆ เสมหะเป็นลบวัฒนธรรมสี่ 2 ตัวอย่างเสมหะพบผลบวกสำหรับ L. pneumophila sg1 ทั้งหมดเจ็ดL. pneumophila sg1 เฉพาะขยายผลิตภัณฑ์มีค่าเฉลี่ยTm ของ 83.43 ± 0.08 C สำหรับ groES, 80.33 ± 0.09 C สำหรับ xcpX และ77.89 ± 0.24 C สำหรับ rfbA สองตัวอย่างเสมหะจากผู้ป่วยที่เกี่ยวกับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลอง
3.1 การเลือกยีนเป้าหมายในการตรวจสอบและความแตกต่าง Legionella
สายพันธุ์
รวม 125 ยีนเป้าหมายผู้สมัครที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อแบคทีเรีย
ระบบการหลั่งโปรตีน (n ¼ 28), การสังเคราะห์ flagellar (n ¼ 25),
และ LPS สังเคราะห์ (n ¼ 6) และความรุนแรงอื่น ๆ ที่รู้จัก ปัจจัยที่
ได้รับการคัดเลือกในทุก 29 Legionella สายพันธุ์โดยในบ้านธรรมดา
PCR ทดสอบ ในหมู่พวกเขาชุดไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับสาม
ยีนถูกพบในการตรวจสอบอย่างเป็นอิสระและความแตกต่างของ
สายพันธุ์เชื้อ Legionella, L. pneumophila และ L. pneumophila sg1.
สามชุดไพรเมอร์ groes กำหนดเป้าหมาย (ที่เฉพาะเจาะจงเพื่อ Legionella ชนิด)
xcpX (ที่เฉพาะเจาะจงเพื่อ L. pneumophila สายพันธุ์) และ rfbA ( L. pneumophila
sg1 เฉพาะ).
3.2 การพัฒนาและการเพิ่มประสิทธิภาพของ multiplex Real-time PCR
First, Simplex Real-time PCR ทดสอบก่อตั้งขึ้น เมื่อ
เส้นโค้งการละลายของ Simplex Real-time PCR มาวิเคราะห์สำหรับแต่ละ
29 Legionella สายพันธุ์ทดสอบผลิตภัณฑ์ขยายในเชิงบวก
สำหรับ groes ยีน xcpX และ rfbA ตรวจพบที่ 83.59 ± 0.33 องศาเซลเซียส,
79.07 ± 0.4 องศาเซลเซียสและ 81 ? C ตามลำดับ ประสิทธิภาพของเครื่องขยาย
ไอออนบวกการพิจารณาโดยใช้ sg1 L. pneumophila ถูก 90.7%, 96.2% และ
S.M. คิม, et al / โมเลกุลและเซลล์ Probes 29 (2015) 414e419 415
94.2% สำหรับ groes ที่ xcpX และ rfbA ยีนตามลำดับ เพื่อ
ประเมินลักษณะเฉพาะของแต่ละ amplicon เราติดใจ amplicons
จาก groes ที่ xcpX และ rfbA ยีน 29 Legionella ชนิด
ลิตร sg1e15 pneumophila และ L. pneumophila sg1 ตามลำดับ.
ในหลอดเดียว multiplex Real-time PCR ทดสอบสามที่แตกต่างกัน
ยอดเขาได้รับการมองเห็นอย่างชัดเจนกับ L. pneumophila sg1 แสดงให้เห็น
positivity สำหรับ groes ยีน xcpX และ rfbA ตัวอย่างดีเอ็นเอจากแต่ละ
ลิตร pneumophila serogroups 2e15 แสดงให้เห็นสองยอดที่เข้ากันได้
กับ groes และ xcpX ขณะที่ไม่ใช่สายพันธุ์เชื้อ Legionella pneumophila
แสดงให้เห็นเพียงหนึ่งยอด groes (รูปที่ 1). ตัวอย่าง L. pneumophila sg1
แสดงให้เห็นสามยอดที่แตกต่างกันที่ 83.6 องศาเซลเซียสสำหรับ groes, 77.4 องศาเซลเซียสสำหรับ xcpX,
และ 80.2 องศาเซลเซียสสำหรับ rfbA อุณหภูมิหลอมละลายเฉลี่ย (TM) สำหรับ groes
ชุดไพรเมอร์เป็น 83.45 ± 0.31 องศาเซลเซียสสำหรับทุกการทดสอบสายพันธุ์เชื้อ Legionella และ
78.2 ± 0.35 องศาเซลเซียสสำหรับ xcpX ใน L. pneumophila sg1e15 (ตารางที่ 1) เรา
สังเกตเห็นความแตกต่างเล็ก ๆ ในยอดเขาละลายในการทดสอบสำหรับ
ยีน groes ระหว่างสามไม่ใช่-L สายพันธุ์ pneumophila และอื่น ๆ
สายพันธุ์เชื้อ Legionella ประเมิน ยอดเขาละลายสำหรับ Legionella
jordanis (84.8 องศาเซลเซียส) และ rubrilucens Legionella (85.2 องศาเซลเซียส) มีค่าสูง
กว่าลิตร pneumophila sg1e15 (83.41 ± 0.14 องศาเซลเซียส) ในขณะที่ค่อนข้าง
สูงสุดหลอมละลายต่ำ (82.6 องศาเซลเซียส) เป็นข้อสังเกตสำหรับ Legionella
sainthelensi (ตารางที่ 1) ไม่มียอดที่เฉพาะเจาะจงที่ถูกตรวจพบในเชิงลบ
ตัวอย่างการควบคุม เวลาจริงผลิตภัณฑ์ PCR multiplex สำหรับ groes,
xcpX และ rfbA ยีนโดย gel electrophoresis ถูกยืนยัน
คาดว่า 274 BP, BP 133 และ 118 bp ในขนาดตามลำดับ (ผลไม่
แสดง).
3.3 ความจำเพาะของ multiplex Real-time PCR
ความจำเพาะของไพรเมอร์ได้รับการทดสอบโดยใช้ 10 ไม่ใช่ Legionella
แบคทีเรีย ไม่มีสินค้าขยายตรวจพบใช้ใด ๆ ของ
เชื้อแบคทีเรียที่ไม่ใช่เชื้อ Legionella (ผลไม่แสดง) ผลการวิจัยนี้ชี้ให้เห็น
ว่านี่ multiplex Real-time PCR การทดสอบเป็นที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ Legionella
ชนิด.
3.4 ความไวของการวิเคราะห์และการทำสำเนาของ multiplex เรียลไทม์
ทดสอบ PCR
ไววิเคราะห์ของ multiplex Real-time PCR การทดสอบ
ได้รับการประเมินโดยใช้เจือจางอนุกรมของเซลล์แบคทีเรีย
ลิตร sg1 pneumophila ล็อดเป็น 3.8? 102 CFU ในรอบ 36.05 (SD,
0.253) (ตารางที่เสริม 3) ประสิทธิภาพการขยายเป็น
88% (รูป. 2A) สำหรับเจือจางอนุกรมของตัวอย่างดีเอ็นเอจาก
ลิตร pneumophila sg1 ค่า LOD 100 FG / mL (เสริม
ตารางที่ 3); ประสิทธิภาพการใช้เครื่องขยายเสียงสูงได้ (99.1%)
(รูป. 2B) เพื่อประเมินการทำสำเนาของการทดสอบที่อนุกรมสิบเท่า
เจือจางของดีเอ็นเอจาก L. pneumophila sg1 ถูกทดสอบใน
multiplex Real-time PCR การเปลี่ยนแปลง (ค่าสัมประสิทธิ์การทดสอบภายใน
ของการเปลี่ยนแปลง, CV) ตั้งแต่ 0.45% เป็น 1.68% และระหว่างการทดสอบ
ความแปรปรวนจาก 0.86% เป็น 1.61% แสดงให้เห็นถึงการทำสำเนา
ผล.
3.5 ความถูกต้องของ multiplex Real-time PCR ทดสอบในตัวอย่างทางคลินิก
และ Legionella แยก
เมื่อต้องการตรวจสอบว่าการทดสอบนี้สามารถนำมาใช้สำหรับการทดสอบของ
สิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยที่สงสัย Legionnaires '
โรคที่ multiplex Real-time PCR การทดสอบได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับการจัดเก็บไว้
ตัวอย่างเสมหะ ตั้งแต่วันที่ 10 ผู้ป่วยที่มีได้มาชุมชน
โรคปอดบวมที่เป็นบวกสำหรับ Legionella ในวัฒนธรรมแบคทีเรีย
ที่ปรึกษาทางการเงินหรือเอือด การทดสอบตัวอย่างเสมหะจากผู้ป่วยที่มี
เชื้อ L. pneumophila sg1 (n ¼ 5) หรือ L. pneumophila serogroups
2e15 (n ¼ 1) เปิดเผยยอดเขาละลายคาด (ตารางที่ 2) ของ
อีกสี่วัฒนธรรมเชิงลบตัวอย่างเสมหะสองตัวอย่างเสมหะ
แสดงให้เห็นผลในเชิงบวกสำหรับ L. pneumophila sg1 ทั้งเจ็ด
ลิตร pneumophila sg1 เฉพาะผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียงมีค่าเฉลี่ย
Tm ของ 83.43 ± 0.08 องศาเซลเซียสสำหรับ groes, 80.33 ± 0.09 องศาเซลเซียสสำหรับ xcpX และ
77.89 ± 0.24 องศาเซลเซียสสำหรับ rfbA สองตัวอย่างเสมหะจากผู้ป่วยที่
มี POSI

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลลัพธ์3.1 . การเลือกยีนเป้าหมายเพื่อตรวจจับและแยกแยะ ลีจิโอเนลลาชนิดทั้งหมด 125 ผู้สมัครเป้าหมายยีนที่เกี่ยวข้องในแบคทีเรียระบบการหลั่งโปรตีน ( N ¼ 28 ) , flagellar ชีวสังเคราะห์ ( N ¼ 25 )สเปรย์หล่อลื่นและชีวสังเคราะห์ ( N ¼ 6 ) และโรคอื่น ๆที่รู้จักปัจจัยมีทั้งหมด 29 ชนิด โดยในบ้านตามปกติ ลีจิโอเนลลาเทคนิคการทดสอบ ในหมู่พวกเขา , รองพื้นเฉพาะชุดสามยีนผู้สมัครพบตรวจจับและแยกแยะอย่างอิสระลีจิโอเนลลา ชนิด L . pneumophila และ L . pneumophila sg1 .ไพรเมอร์ groes เป้าหมาย 3 ชุด ( เฉพาะ Legionella Species )xcpx ( เฉพาะ . pneumophila ชนิดและ rfba pneumophila ( Lsg1 เฉพาะ )3.2 . การพัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพของ PCR แบบเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์แรก , เรียลไทม์ PCR assay เริมก่อตั้งขึ้น เมื่อเส้นโค้งของเชื้อเริมละลายแบบเรียลไทม์วิเคราะห์แต่ละ29 Legionella ชนิดทดสอบผลิตภัณฑ์แบบบวกสำหรับ groes xcpx , และ rfba ยีนที่ตรวจพบ 83.59 ± 0.33 C79.07 ± 0.4 องศาเซลเซียส และ 81 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ประสิทธิภาพของ amplifi -การกำหนดใช้ L . pneumophila sg1 เป็นร้อยละเปอร์เซ็นต์ ยังคงเป็นเปอร์เซ็นต์s.m. Kim et al . / โมเลกุลและเซลล์ ) 29 ( 2015 ) 414e419 415groes xcpx 94.2 % สำหรับ , และ rfba ยีนตามลำดับ เพื่อประเมินความจำเพาะของแต่ละคนและเราทำการ ampliconsจาก groes xcpx rfba , และยีน Legionella 29 ชนิดฉัน pneumophila sg1e15 และ pneumophila sg1 ตามลำดับในหลอดเดียว multiplex PCR แบบเรียลไทม์ โดยสามแตกต่างกันยอด ก็มองเห็นด้วย L . pneumophila sg1 แสดงทั้งสำหรับ groes xcpx , และ rfba ยีน แต่ละตัวอย่างดีเอ็นเอจากฉัน pneumophila ไวรัสจุดขาวในกุ้ง 2e15 พบสองยอด เข้ากันได้และด้วย groes xcpx ในขณะที่ไม่ pneumophila Legionella Speciesพบว่ามีเพียงหนึ่งสูงสุด groes ( รูปที่ 1 ) ตัวอย่าง pneumophila sg1 Lพบสามยอดเขาที่แตกต่างกันที่ groes 18 C , C xcpx 77.4 ,80.2 และ C rfba . อุณหภูมิเฉลี่ย ( TM ) สำหรับ groes ละลายไพรเมอร์ชุด± 83.45 0.31 C สำหรับการทดสอบทั้งหมด Legionella species และกา± 0.35 C xcpx ในแอล. pneumophila sg1e15 ( ตารางที่ 1 ) เราสังเกตความแตกต่างในการละลายยอดในการทดสอบสำหรับgroes ยีนระหว่างสาม non-l. pneumophila ชนิดอื่น ๆLegionella Species ประเมิน ละลายสเปกตรัมลีจิโอเนลลาjordanis ( ใหญ่ C ) และลีจิโอเนลลา rubrilucens ( 85.2 C ) สูงขึ้นกว่าผม pneumophila sg1e15 ( 83.41 ± 0.14 C ) ในขณะที่ค่อนข้างยอดเขาละลายต่ำ ( 82.6 C ) เป็นสังเกตสำหรับลีจิโอเนลลาsainthelensi ( ตารางที่ 1 ) ไม่มีพบสำหรับลบยอดที่เฉพาะเจาะจงตัวอย่างควบคุม การมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์พีซีอาร์เพื่อ groes ผลิตภัณฑ์ ,และ xcpx rfba ยีน gel electrophoresis ได้ยืนยันคาดว่า 274 / 133 BP และ 118 BP ขนาดตามลำดับ ( ผลไม่แสดง )3.3 . ของ PCR แบบเรียลไทม์มัลติมีความจำเพาะความจำเพาะของวิธีทดสอบโดยใช้ 10 โนนลีจิโอเนลลาแบคทีเรีย ไม่พบสินค้าแบบใช้ใด ๆของแบคทีเรีย Legionella โนน ( ผลลัพธ์ไม่แสดง ) ผลการศึกษาแนะนำนี้ เรียลไทม์พีซีอาร์ ( multiplex คือเฉพาะลีจิโอเนลลาชนิด3.4 . วิเคราะห์และตรวจสอบความไวของเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์เทคนิคการทดสอบความไวของวิธี multiplex PCR แบบเรียลไทม์วิเคราะห์ใช้วิธีการประเมินแบบอนุกรมเซลล์เชื้อแบคทีเรียฉัน pneumophila sg1 . LOD คือ 3.8 102 CFU ใน 36.05 รอบ ( SD ,0.253 ) ( ตารางเพิ่มเติม 3 ) โดยการเพิ่มประสิทธิภาพ คือ88% ( รูปที่ 2A ) สำหรับซีเรียลเจือจางตัวอย่างดีเอ็นเอจากฉัน pneumophila sg1 , LOD 100 fg / ml ( เสริมตารางที่ 3 ) , ประสิทธิภาพ ( สูงได้ ( 97.2 % )( รูปที่ 2B ) การประเมินตรวจสอบของการทดสอบอนุกรมสิบพับวิธีการสกัดดีเอ็นเอจาก pneumophila sg1 ทดสอบ Lส่วน PCR แบบเรียลไทม์มัลติเพล็กซ์ ภายในการเปลี่ยนแปลงค่าสัมประสิทธิ์การทดสอบการแปรผัน , CV ) อยู่ระหว่าง 0.45 % 1.68 เปอร์เซ็นต์ และระหว่างการทดสอบความผันแปรจาก 0.86 ร้อยละ 1.61 % ถึงกระชับผลลัพธ์3.5 . ความถูกต้องของวิธี multiplex PCR แบบเรียลไทม์ในตัวอย่างทางคลินิกและ เชื้อลีจิโอเนลลาเพื่อตรวจสอบว่าวิธีนี้สามารถใช้สำหรับการทดสอบของคลินิกตัวอย่าง จากผู้ป่วยที่สงสัยว่า " ลีเจียนแนร์โรค , multiplex PCR แบบเรียลไทม์ โดยมีการจัดเก็บ10 ตัวอย่างจากเสมหะผู้ป่วย community-acquiredโรคปอดอักเสบที่เป็นบวก แบคทีเรีย Legionella ใน ,ไอ หรือ uat . ทดสอบตัวอย่างจากผู้ป่วยมีเสมหะเชื้อ L . pneumophila sg1 ( N ¼ 5 ) หรือ ไวรัสจุดขาวในกุ้ง pneumophila L2e15 ( N ¼ 1 ) เปิดเผยคาดการณ์ยอดละลาย ( ตารางที่ 2 ) ของสี่อื่น ๆวัฒนธรรมเชิงลบเสมหะตัวอย่างสองตัวอย่างเสมหะแสดงผลลัพธ์ที่เป็นบวกสำหรับฉัน pneumophila sg1 . ทั้งหมดเจ็ดฉัน pneumophila sg1 แบบเฉลี่ยเฉพาะผลิตภัณฑ์TM ของ 83.43 ± 0.08 C groes 80.33 , ± 0.09 C xcpx , และความเร็ว± 0.24 C rfba . สองตัวอย่างจากผู้ป่วยที่มีเสมหะเป็น posi