2.8. Western blot analysisCells in

2.8. Western blot analysis
Cells in each group were lysed with RIPA lysis buffer for extracting cell total protein
The lysates were centrifuged at 12,000 g for 10 min at
Then the supernatants were assayed for protein concentration using the BCA method
After solubilized in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels (SDS-PAGE) sample buffer and heated in boiling water for 10 min, 100 μg protein was separated on 10% SDS-PAGE
and transferred onto nitrocellulose (NC) membranes
Then the membranes
were blocked with 5% skimmed milk powder in TBST for 1 h
followed by incubation with primary antibodies (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1,mTOR, TSC1, LC3II) for 2 h at room temperature and overnight at 4 1C. Wash the membranes with PBST three times for 10 min each and incubate the membranes with horseradish peroxidase (HRP)
conjugated secondary antibodies

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.8 เวสเทิร์วิเคราะห์ blot
เซลล์ในแต่ละกลุ่มถูก lysed กับ RIPA lysis บัฟเฟอร์สำหรับการสกัดโปรตีนเซลล์รวม
lysates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่
แล้ว supernatants ถูก assayed สำหรับความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้วิธีการเก็บกวาด
หลังจากละลายโซเดียมเจลโดเดซิลซัลเฟตอะคริเลต ( ระบบ SDS-PAGE) บัฟเฟอร์ตัวอย่างและให้ความร้อนในน้ำเดือด 10 นาที 100 โปรตีนไมโครกรัมถูกแยกออกมาเมื่อวันที่ 10% SDS-PAGE
และโอนไปยัง nitrocellulose (NC) เยื่อ
แล้วเยื่อ
ถูกบล็อก 5% ผงนมไขมันต่ำใน TBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ตามด้วยการบ่มกับแอนติบอดีปฐมภูมิ (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1 mTOR, TSC1, LC3II) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและค้างคืนที่ 4 1C ล้างเยื่อด้วย PBST สามครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้งและฟักไข่เยื่อกับมะรุม peroxidase (HRP)
แอนติบอดีรองผัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.8 . Western blot analysisเซลล์ในแต่ละกลุ่ม ด้วยการสลายบัฟเฟอร์ lysed RIPA สกัดโปรตีนเซลล์ทั้งหมดการ lysates เป็นระดับที่ 12 , 000 G สำหรับ 10 นาทีที่แล้ว supernatants มีปริมาณความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้แนวคิดวิธีสำหรับหลังจากสารละลายโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตโพลีอะคริลาไมด์เจลใน ( SDS-PAGE ) ตัวอย่างบัฟเฟอร์และให้ความร้อนในน้ำเดือด 10 นาที μ 100 กรัมโปรตีนแยกบน 10% SDS-PAGEและโอนไปยังไนโตร ( NC ) เมมเบรนแล้วต่างที่ถูกบล็อกด้วย 5 % นมผงใน tbst เป็นเวลา 1 ชั่วโมงตามด้วยการบ่มด้วยแอนติบอดีหลัก ( บัญชี ) ampk pampk cpt-1 , , , , tsc1 mtor , , lc3ii ) 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง และค้างคืนที่ 4 c . ล้างเมมเบรนที่มี pbst 3 ครั้ง เป็นเวลา 10 นาทีและบ่มเพาะเยื่อกับ horseradish peroxidase ( HRP )และแอนติบอดี มัธยมศึกษา