Amylase assaysFor qualitative assay

Amylase assays
For qualitative assays, recombinant S. cerevisiae strains were cultured on SC-URA plates containing 2% soluble corn starch for 48 hours at 30°C. The plates were transferred to 4°C to allow precipitation of the residual starch, resulting in clear zones around colonies secreting α-amylases.

For quantitative assays, yeast transformants were cultured in 20 ml double-strength SC-URA medium in 125 ml Erlenmeyer flasks for 3 days with agitation at 200 rpm. The supernatant was harvested and enzyme activity levels were determined after 5 minutes with the reducing sugar assay [44] in citrate-phosphate buffer containing 0.2% soluble corn starch at 30°C and pH 5. For glucoamylase activity, 50 μl supernatant was incubated for 5 minutes with 450 μl of a 0.2% soluble corn starch solution (30°C, pH 5). The resulting glucose concentration was determined with the D-Glucose Assay Kit (Megazyme, Ireland). Enzyme activity was expressed as U ml-1 supernatant, with one unit defined as the amount of enzyme required to release 1 μmole of glucose per minute. The assays were repeated for S. cerevisiae Y294[AmyA] and Y294[GlaA] at different pH (pH 3, 4, 5, 6 and 7) and temperature values (30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C and 80°C).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Amylase assays
สำหรับ assays คุณภาพ recombinant S. cerevisiae สายพันธุ์ที่อ่างบนแผ่น SC URA ที่ประกอบด้วยแป้งข้าวโพดละลายน้ำ 2% ภายใน 48 ชั่วโมงที่ 30 องศาเซลเซียส แผ่นถูกโอนย้ายไปที่ 4° C ให้ฝนของแป้งส่วนที่เหลือ ในโซนชัดเจนทั่วอาณานิคม secreting α-amylases

สำหรับ assays เชิงปริมาณ transformants ยีสต์มีอ่างใน 20 ml คู่แรง SC URA ในน้ำ 125 ml Erlenmeyer 3 วันมีอาการกังวลต่อที่ 200 รอบต่อนาที Supernatant ถูกเก็บเกี่ยว และระดับกิจกรรมของเอนไซม์ถูกกำหนดหลังจาก 5 นาทีด้วยการลดน้ำตาลวิเคราะห์ [44] ในฟอสเฟตซิเตรตบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 0.2% แป้งข้าวโพดละลายน้ำที่ 30° C และค่า pH 5 สำหรับกิจกรรม glucoamylase 50 μl supernatant ถูก incubated 5 นาทีกับ μl 450 ของ 0.2% ละลายน้ำข้าวโพดแป้งโซลูชัน (30° C ค่า pH 5) กำหนดความเข้มข้นกลูโคสได้ ด้วยชุดทดสอบของ D-กลูโคส (Megazyme ไอร์แลนด์) เอนไซม์ถูกแสดงเป็น U ml 1 supernatant กับหน่วยหนึ่งที่กำหนดเป็นจำนวนของเอนไซม์ที่จำเป็นต้องปล่อย μmole 1 ของกลูโคสต่อนาที Assays ถูกทำซ้ำสำหรับ s cerevisiae Y294 [AmyA] และ Y294 [GlaA] ที่แตกต่างกันค่า pH (pH 3, 4, 5, 6 และ 7) และค่าอุณหภูมิ (30° C, 40° C, 50° C, 60° C, 70° C และ 80° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตรวจอะไมเลส
สำหรับการตรวจคุณภาพ recombinant สายพันธุ์ S. cerevisiae ถูกเพาะเลี้ยงบนจาน SC-URA ที่มีแป้งข้าวโพดที่ละลายน้ำ 2% เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 30 ° C. จานถูกย้ายไป 4 ° C เพื่อให้ตกตะกอนของแป้งที่เหลือทำให้เกิดวงใสรอบโคโลนีลอบα-อะไมเลสสำหรับการตรวจเชิงปริมาณ transformants ยีสต์เพาะเลี้ยงใน 20 มล. สองแรง SC-URA ขนาดกลางใน 125 มล. ขวด Erlenmeyer 3 วันที่มีการกวนที่ 200 รอบต่อนาที ใสได้รับการเก็บเกี่ยวและระดับเอนไซม์ได้รับการพิจารณาหลังจาก 5 นาทีด้วยการทดสอบการลดน้ำตาล [44] ในบัฟเฟอร์ซิเตรทฟอสเฟตที่มีแป้งข้าวโพดที่ละลายน้ำได้ 0.2% ที่ 30 ° C และพีเอช 5. สำหรับกิจกรรม glucoamylase 50 ไมโครลิตรใสได้รับการบ่ม 5 นาทีด้วย 450 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาแป้งข้าวโพดที่ละลายน้ำได้ 0.2% (30 ° C, pH 5) ความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคสที่เกิดขึ้นถูกกำหนดด้วย D-กลูโคสชุดทดสอบ (Megazyme, ไอร์แลนด์) เอนไซม์ถูกแสดงเป็น U ml-1 ใสกับหนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นในการปล่อย 1 μmoleของกลูโคสต่อนาที การตรวจซ้ำกับ S. cerevisiae Y294 [AmyA] และ Y294 [GlaA] ที่ pH ที่แตกต่างกัน (pH 3, 4, 5, 6 และ 7) และค่าอุณหภูมิ (30 ° C, 40 ° C 50 ° C, 60 ° C, 70 ° C และ 80 ° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ใช้สำหรับทดสอบคุณภาพแป้ง
, S . cerevisiae สายพันธุ์ของเซลล์เพาะเลี้ยง sc-ura จานที่มี 2 % แป้งละลายข้าวโพดเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 30 องศา จานที่ถูกโอนไปยัง 4 ° C เพื่อให้ตกตะกอนแป้งที่เหลือ ซึ่งในโซนใสรอบโคโลนีหลั่งแอลฟากลุ่ม พันธมิตรประชาชนเพื่อประชาธิปไตย

สำหรับวิธีเชิงปริมาณพลาสมิดยีสต์เพาะเลี้ยงในความแรงของคู่ sc-ura ขนาดกลางใน 125 มล. เออร์เลนเมเยอร์ขวด 3 วันด้วยการกวน 200 รอบต่อนาที 20 ml . และน่านคือการเก็บเกี่ยวและระดับกิจกรรมของเอนไซม์พบว่าหลังจาก 5 นาทีกับปริมาณน้ำตาล ) [ 44 ] ในซิเตรทฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มี 0.2 % แป้งข้าวโพด 30 ° C และที่ pH 5 สำหรับกิจกรรมของเอนไซม์กลูโคอะไมเลส ,50 μผมนำถูกบ่มนาน 5 นาทีกับ 450 μ l 0.2% ละลายแป้งข้าวโพดโซลูชั่น ( 30 ° C , pH 5 ) ส่งผลให้ปริมาณน้ำตาลกลูโคสถูกกำหนดด้วยดี กูลโคส 3 ชุด ( megazyme , ไอร์แลนด์ ) กิจกรรมของเอนไซม์จะแสดงเป็นคุณแน่นอนสูง กับหนึ่งหน่วย เช่น ปริมาณของเอนไซม์ ต้องปล่อย 1 μโมลกลูโคสต่อนาที หรือเป็นซ้ำสำหรับ sโดย y294 [ amya ] และ [ ] ที่แตกต่างกัน y294 glaa pH ( pH 3 , 4 , 5 , 6 และ 7 ) และค่าอุณหภูมิ 30 องศา C 40 ° C 50 ° C 60 ° C 70 ° C และ 80 ° C )