On all days, cell cultures were pre

On all days, cell cultures were prepared from either 1.5 or 6 g of muscle (for embryos and posthatch, respectively) sampled from a pool of chopped muscle from 10 embryos or chicks (as described in Halevy and Lerman, 1993). Cells were counted using a hemocytometer, and plated at 5 × 104 cell/cm2 on gelatin-coated dishes. The medium was minimal essential medium (MEM) with 10% (vol/vol) horse serum and 3% (vol/vol) chicken embryo extract (Gibco, Paisley, UK) for cells derived from embryos, or 10% horse serum-containing Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) for cells from posthatch chicks. Cells were maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 95% air and 5% CO2.

Thymidine Incorporation
Myoblast proliferation ability was evaluated using [3H]thymidine incorporation as previously described by Halevy et al. (2000, 2001). Briefly, cells were cultured in 24-well plates (n = 8) for 17 h, and [3H]thymidine (Amersham, Uppsala, Sweden) was added (2 μCi/well) for an additional 2 h. The cells were then detached with 0.25% (wt/vol) trypsin-EDTA and precipitated with 10% (wt/vol) trichloroacetic acid. Radioactivity in the dissolved precipitates was counted in Ultima Gold scintillation fluid (Packard, Downers Grove, IL) using a Tri-Carb 1600CA scintillation counter (Packard).

Western Blot Analysis
The expression levels of myogenin in the muscle were analyzed by Western blot and subsequent densitometry analysis (Halevy et al., 2006a). Briefly, muscle samples were collected from the right half of the pectoralis muscle (n = 5) and immediately frozen in liquid nitrogen. Samples were homogenized, and extracts were ultrasonicated and normalized for protein content (BCA kit, Pierce, Rockford, IL). Equal amounts of protein from muscle extracts were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), which were then incubated overnight at 4°C with myogenin antibody (rabbit polyclonal, a kind gift from B. Paterson, National Institutes of Health, Bethesda, MD), washed and incubated with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Zymed, San Francisco, CA). Densitometric analysis was performed on bands, and intensity was normalized to the level of α-tubulin as an internal standard.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เวลาทั้งหมด วัฒนธรรมเซลล์ถูกเตรียมจาก 1.5 หรือ 6 กรัมของกล้ามเนื้อ (โคลนและ posthatch ตามลำดับ) ตัวอย่างจากกลุ่มของกล้ามเนื้อสับจากโคลนหรือลูกไก่ 10 (ตามที่อธิบายไว้ใน Halevy เลอร์แมน 1993) เซลล์นับได้โดยใช้การ hemocytometer และชุบที่ 5 × 104 เซลล์/cm2 บนเคลือบตุ๋นอาหาร สื่อเป็นสื่อสำคัญน้อยที่สุด (MEM) 10% (vol/vol) ม้าซีรั่มและ 3% (vol/vol) ไก่อ่อนสกัดจาก (Gibco, Paisley สหราชอาณาจักร) สำหรับเซลล์ที่มาจากโคลน หรือม้า 10% ซีรั่ม-ประกอบด้วยของดุลเบกโกแก้ไขอีเกิ้ลขนาดกลาง (DMEM) สำหรับเซลล์จากลูกไก่ posthatch เซลล์ได้รับการดูแลรักษาที่ 37° C ในบรรยากาศ humidified air 95% และ 5% CO2ประสาน thymidineความสามารถในการงอก Myoblast ได้ถูกประเมินโดยใช้ [3H] thymidine ประสานอธิบายไว้โดย al. et Halevy เป็นก่อนหน้านี้ (2000, 2001) สั้น ๆ เซลล์มีอ่างในดี 24 แผ่น (n = 8) 17 h และ [3H] thymidine (Amersham, Uppsala สวีเดน) เพิ่ม (2 μCi/ดี) สำหรับ h 2 เพิ่มเติม เซลล์ได้แล้วเดี่ยว ด้วย 0.25% (wt/vol) ทริปซิน-EDTA และตกตะกอน ด้วยกรด trichloroacetic 10% (wt/vol) Radioactivity ใน precipitates ละลายถูกนับในทวีดอัลติมาทอง scintillation น้ำมัน (Packard, Downers โกรฟ IL) ใช้เคาน์เตอร์ scintillation 1600CA ตรีคาร์บูเรเตอร์ (Packard)วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาระดับนิพจน์ของ myogenin ในกล้ามเนื้อถูกวิเคราะห์ โดยคืนในตาตะวันตกและ densitometry ต่อมาวิเคราะห์ (Halevy et al., 2006a) สั้น ๆ ตัวอย่างกล้ามเนื้อถูกเก็บรวบรวมจากครึ่งขวาของกล้ามเนื้อ pectoralis (n = 5) และแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที ตัวอย่างถูก homogenized เป็นกลุ่ม และสารสกัดจาก ultrasonicated และตามปกติสำหรับโปรตีน (BCA ชุด เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL) จำนวนเท่าของโปรตีนจากกล้ามเนื้อบางส่วนถูกคั่น ด้วย SDS หน้า และโอนย้ายไป nitrocellulose เยื่อหุ้ม (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย), ซึ่งถูก incubated ค้างคืนที่ 4° C มีแอนติบอดี myogenin (polyclonal กระต่าย ของขวัญดีจากบีทเทอร์ ชาติสถาบันสุขภาพ เบเทสดา MD), เครื่องซักผ้า แล้ว incubated กับ horseradish กระต่ายป้องกันแพะ peroxidase กลวง IgG (Zymed, San Francisco, CA) ทำตามวงการวิ densitometric และความเข้มได้ตามปกติด้วยกองทัพ-tubulin เป็นมาตรฐานภายในเป็นระดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในวันที่ทุกเซลล์เพาะเลี้ยงที่เตรียมจากทั้ง 1.5 หรือ 6 กรัมของกล้ามเนื้อ (สำหรับตัวอ่อนและ posthatch ตามลำดับ) ตัวอย่างจากสระว่ายน้ำของกล้ามเนื้อสับจาก 10 ตัวอ่อนหรือลูกไก่ (ตามที่อธิบายไว้ใน Halevy และ Lerman, 1993) เซลล์ที่ถูกนับใช้ hemocytometer และชุบที่ 5 × 104 เซลล์ / cm2 ในอาหารเจลาตินเคลือบ กลางเป็นที่สุดขนาดกลางที่สำคัญ (MEM) 10% (ปริมาตร / ปริมาตร) ซีรั่มม้าและ 3% (ปริมาตร / ปริมาตร) ตัวอ่อนไก่สารสกัด (Gibco ลายสหราชอาณาจักร) สำหรับเซลล์ที่ได้มาจากตัวอ่อนหรือ 10% ม้าเซรั่มที่มีส่วนผสมของ Dulbecco ของอีเกิลดัดแปลงกลาง (DMEM) สำหรับเซลล์จากลูกไก่ posthatch เซลล์ที่ถูกเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศที่มีความชื้น 95% อากาศและ 5% CO2. Thymidine จดทะเบียนMyoblast ความสามารถในการขยายการประเมินโดยใช้ [3H] thymidine การรวมตัวกันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Halevy et al, (2000, 2001) สั้น ๆ , เซลล์เพาะเลี้ยงในแผ่น 24 หลุม (n = 8) 17 ชั่วโมงและ [3H] thymidine (Amersham อัปซาลา, สวีเดน) ถูกเพิ่มเข้ามา (2 μCi / กัน) สำหรับอีก 2 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกถอดออกแล้วกับ 0.25% (น้ำหนัก / ปริมาตร) trypsin-EDTA และตกตะกอนที่มี 10% (น้ำหนัก / ปริมาตร) กรดไตรคลอโร กัมมันตภาพรังสีในตะกอนละลายถูกนับในที่สุดน้ำทองประกาย (แพคการ์ดเนอร์สโกรฟ, IL) โดยใช้ Tri-Carb 1600CA ประกายเคาน์เตอร์ (Packard). ดวงตะวันวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของ myogenin ในกล้ามเนื้อได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี Western blot และต่อมา การวิเคราะห์ความหนาแน่น (Halevy et al., 2006a) สั้น ๆ ตัวอย่างกล้ามเนื้อถูกเก็บรวบรวมจากครึ่งขวาของกล้ามเนื้อกล้ามเนื้อนี้ (n = 5) และแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างหดหายและสารสกัดถูก ultrasonicated และปกติปริมาณโปรตีน (ชุดเก็บกวาดเพียร์ซ, ฟอร์ด, IL) ปริมาณที่เท่ากันของโปรตีนจากสารสกัดจากกล้ามเนื้อถูกแยกออกจากระบบ SDS-PAGE และโอนไปยังเยื่อ nitrocellulose (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, ดาว, CA) ซึ่งถูกบ่มแล้วค้างคืนที่ 4 ° C ที่มีแอนติบอดี myogenin (กระโพลี, ของขวัญชนิดจาก B . แพ็ตเตอร์สัน, สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, Bethesda, MD) ล้างและบ่มกับแพะมะรุม peroxidase-ผัน IgG ต่อต้านกระต่าย (Zymed, San Francisco, CA) การวิเคราะห์ Densitometric ได้ดำเนินการเกี่ยวกับวงดนตรีและความรุนแรงได้ในระดับปกติของα-tubulin เป็นมาตรฐานภายใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในทุกวัน เซลล์วัฒนธรรมที่เตรียมจาก 1.5 หรือ 6 กรัมของกล้ามเนื้อ ( สำหรับตัว และ posthatch ตามลำดับ ) ตัวอย่างจากสระว่ายน้ำของกล้ามเนื้อจาก 10 เปอร์เซ็นต์ หรือไก่สับ ( ตามที่อธิบายไว้ในเฮลวี่ และ เลอร์แมน , 1993 ) เซลล์จะถูกตรวจนับการใช้ hemocytometer และชุบ 5 × 104 เซลล์ / cm2 บนวุ้นอาหารเคลือบสื่อคือสื่อน้อยที่สุดที่จำเป็น ( แหม่ม ) กับ 10 % ( ปริมาตร / ปริมาตร ) ซีรั่มม้า และ 3 เปอร์เซ็นต์ ( ปริมาตร / ปริมาตร ) สารสกัดจากตัวอ่อนไก่ ( gibco Paisley , สหราชอาณาจักร , ) สำหรับเซลล์ที่ได้มาจากตัวอ่อน หรือ 10% เซรั่มที่มีม้าดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ) เซลล์จากลูกไก่ posthatch . เซลล์ที่ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 37 ° C ในบรรยากาศที่มีอากาศ humidified 95% และ 5% CO2 เพียงรวมตัวกัน
.

ความสามารถในการ myoblast ถูกประเมินโดยใช้ [ 3H ] ก่อนหน้านี้เป็นเพียงการอธิบายโดยเฮลวี่ et al . ( 2000 , 2001 ) สั้น ๆ เซลล์ที่เพาะเลี้ยงในจาน 24 ดี ( n = 8 ) 17 H , [ 3 ] ไทมิดีน ( ชาม อุปซอลา , สวีเดน ) เพิ่ม ( 2 μ CI / ดี ) เพิ่มอีก 2 ชั่วโมง เซลล์แล้วเดี่ยวกับ 025 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) ทริป EDTA และตกตะกอนด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) กรดไตรคลอโรอะซิติก . กัมมันตภาพรังสีในน้ำตะกอนถูกนับในประกายทองของของเหลว ( Packard , ดาวเนอร์สโกรฟ , อิลลินอยส์ ) โดยใช้ข้อมูล 1600ca ไตร carb เคาน์เตอร์ ( g )


Western blot การวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของ myogenin ในกล้ามเนื้อ วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ densitometry blot ตะวันตกและต่อมา ( เฮลวี่ et al . , 2006a ) สั้น , ตัวอย่างกล้ามเนื้อเก็บมาจากครึ่งขวาของกล้ามเนื้อสันใน ( n = 5 ) และทันทีที่แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างที่บดและสารสกัดเป็น ultrasonicated และคะแนนทีปกติสำหรับโปรตีน ( โปรตีนชุด Rockford , แทง ,อิลลินอยส์ ) จํานวนเงินที่เท่ากันของโปรตีนสกัดแยกจากกล้ามเนื้อถูกโอนไปยังเมมเบรนไนโตร ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) ซึ่งถูกบ่มค้างคืนที่ 4 ° C ( กระต่าย myogenin แอนติบอดีโพลี ของขวัญชนิดจากบี ปีเตอร์สัน สถาบันสุขภาพแห่งชาติ , Bethesda , MD )ล้างและแยกเอนไซม์มะรุมและ IgG anti กระต่ายแพะ ( zymed , ซานฟรานซิสโก ( CA ) การวิเคราะห์ densitometric ถูกแสดงบนแถบ และความเข้มสูงถึงระดับแอลฟาทูบูลินเป็นมาตรฐานภายใน