2.3. RT-PCRBased on the sequences r

2.3. RT-PCR
Based on the sequences reported by Trojnar et al. (2010), specific
primers were designed targeting at the gene coding for the
VP6 protein of the RVs-D, using the Primer BLAST program available
at NCBI. The forward primer used in this study was RD6F
(5
-GGAGGCGCTGTCTTCAATTGCG-3
) and the reverse primer was
RD6R (5
-TGGCCAATAGTGTGTGGCAGCT-3
), which were used to
amplify a 742-bp fragment.
The RT-PCR for detection of RVs-D samples was carried out in
two steps. To obtain the cDNA, 3 L of the extracted dsRNA was
added to the pair of primers followed by denaturation during 5 min
at 95 ◦C and chilling on ice thereafter. The first step was reverse
transcription carried out using a final volume of 25 L including
16.5 L of H2O free of RNase and DNase, 2.5 L of 10× buffer
(Invitrogen), 1 L of dNTPs (10 mM, Invitrogen), 0.75 L of MgCl2
(50 mM, Invitrogen), 0.25 L of RT (SuperScriptTM II, 20U, Invitrogen),
and 0.5 L of each primer (20 mM, Invitrogen). The reaction
was incubated at 42 ◦C for 1 h. The second step was represented by
PCR performed by adding 25 L of PCR reagents to the cDNA sample
for a final reaction volume of 50 L. The PCR reagents included
18.5 L of H2O free of RNase and DNase, 2.5 L of 10× First-Stand
Buffer, 3 L of dNTPs (10 mM), 0.75 L of MgCl2 (50 mM,), 0.25 L
of Taq DNA polymerase (2.5 U/L, Invitrogen), with the following
cycling conditions: 93 ◦C for 3 min, 35 cycles of 93 ◦C for 1 min, 55 ◦C
for 1 min, and 72 ◦C for 1 min, with a final incubation at 68 ◦C for
7 min. The PCR products were analyzed by gel electrophoresis on
a 1.5% agarose gel with TBE buffer, and the gel was stained with
SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen). Visualization of the 742-bp
band was conducted using a GEL DOC 1000 instrument.
Todetermine the sensitivity ofthemethod, a PCR wasperformed
including 10-fold serial dilutions of cleansed recombinant colonies
containing the fragment of VP6 of the RVs-D, with initial concentration
of 50 ng/L and final concentration of 5 × 10−5 ng/L.
2.4. Cloning and se

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. RT-PCRอิงจากลำดับที่รายงานโดย Trojnar et al. (2010), เฉพาะไพรเมอร์ออกแบบมาที่เขียนโค้ดยีนสำหรับการกำหนดเป้าหมายการโปรตีน vp6 มันของ RVs-D ใช้โปรแกรมรองพื้นระเบิดที่พร้อมที่ NCBI รองพื้นไปข้างหน้าที่ใช้ในการศึกษานี้คือ RD6F(5-GGAGGCGCTGTCTTCAATTGCG-3) และไพรเมอร์ย้อนกลับRD6R (5-TGGCCAATAGTGTGTGGCAGCT-3), ซึ่งเคยใช้ขยายส่วน 742 bpRT-PCR สำหรับการตรวจจับของ RVs-D ตัวอย่างดำเนินการในขั้นตอนที่สอง การขอรับการ cDNA, 3 L ของ dsRNA แยกถูกลงคู่ของไพรเมอร์ตาม ด้วยแปรสภาพในช่วง 5 นาทีที่ 95 ◦C และหนาวบนน้ำแข็งหลังจากนั้น ขั้นตอนแรกถูกย้อนกลับการถอดรหัสที่ดำเนินการโดยใช้ไดรฟ์ข้อมูลขั้นสุดท้ายรวมถึง 25 L16.5 L ของ H2O ฟรีของ RNase DNase, 2.5 L ของบัฟเฟอร์× 10(Invitrogen), 1 L ของ dNTPs (10 มม. Invitrogen), 0.75 ลิตรของ MgCl2(50 มม. Invitrogen), 0.25 L ของ RT (SuperScriptTM II, 20U, Invitrogen),และ 0.5 L แต่ละพื้น (20 มม. Invitrogen) การเกิดปฏิกิริยาincubated ที่ ◦C 42 สำหรับ 1 h ขั้นตอนสองถูกแทนด้วยดำเนินการ โดยการเพิ่ม L 25 ของ PCR reagents อย่าง cDNA PCRสำหรับ 50 L. ระดับปฏิกิริยาสุดท้าย เปื้อน PCR รวม18.5 L ของ H2O ฟรีของ RNase DNase, 2.5 L ของ 10 ×แรกยืนบัฟเฟอร์ dNTPs (10 mM), 0.75 ลิตรของ MgCl2 (50 มม.,), 0.25 L 3 Lของ Taq DNA พอลิเมอเรส (2.5 U/L, Invitrogen), กับต่อไปนี้สภาพขี่จักรยาน: 93 ◦C เป็นเวลา 3 นาที 35 93 ◦C รอบ 1 นาที 55 ◦C1 นาที และ ◦C 72 1 นาที กับการบ่มขั้นสุดท้ายที่ 68 ◦C สำหรับ7 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวิเคราะห์ โดยอิเจบน1.5% agarose เจลกับบัฟเฟอร์ TBE และเจถูกย้อมด้วยดีเอ็นเอปลอดภัย SYBR เจคราบ (Invitrogen) ภาพแสดง 742-bpวงดนตรีดำเนินการโดยใช้เครื่องมือเจ DOC 1000Todetermine ofthemethod ไว wasperformed การ PCRรวม 10-fold อนุกรมเจือจางทา recombinant อาณานิคมที่ประกอบด้วยส่วนของ vp6 มันของ RVs-D มีความเข้มข้นเริ่มต้น50 ng/L และความเข้มข้นสุดท้ายของฉบับ 5 × 10−5 แยก2.4. การโคลน และ se

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 RT-PCR
จากลำดับที่รายงานโดย Trojnar et al, (2010) เฉพาะ
ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบที่กำหนดเป้าหมายยีนสำหรับ
โปรตีน VP6 ของ RVs-D โดยใช้โปรแกรม BLAST ไพรเมอร์ที่มีอยู่
ใน NCBI ไพรเมอร์รอคอยที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้คือ RD6F
(5
-GGAGGCGCTGTCTTCAATTGCG-3
) และไพรเมอร์กลับเป็น
RD6R (5
-TGGCCAATAGTGTGTGGCAGCT-3
) ซึ่งถูกนำมาใช้เพื่อ
ขยายส่วน 742-BP.
RT-PCR ในการตรวจหา RVs- ตัวอย่าง D ได้ดำเนินการใน
ขั้นตอนที่สอง การขอรับ cDNA 3 ลิตรสกัด dsRNA ถูก
เพิ่มให้กับคู่ของไพรเมอร์ตามมาด้วยการสูญเสียสภาพธรรมชาติในช่วง 5 นาที
ที่ 95 ◦Cและหนาวเหน็บบนน้ำแข็งนั้นไม่นาน ขั้นตอนแรกคือการย้อนกลับ
ถอดความดำเนินการโดยใช้ปริมาณสุดท้ายของ 25 L รวม
16.5 ลิตร H2O ฟรี RNase และ DNase, 2.5 ลิตร 10 ×บัฟเฟอร์
(Invitrogen) 1 ลิตรของ dNTPs (10 มิลลิ, Invitrogen) 0.75 ลิตร MgCl2
(ขนาด 50 มม, Invitrogen) 0.25 ลิตร RT (SuperScriptTM II, 20U, Invitrogen)
และ 0.5 ลิตรของแต่ละไพรเมอร์ (20 มิลลิเมตร, Invitrogen) ปฏิกิริยาที่
ถูกบ่มที่ 42 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ขั้นตอนที่สองเป็นตัวแทนจาก
PCR ดำเนินการโดยการเพิ่ม 25 ลิตรน้ำยา PCR ตัวอย่าง cDNA
สำหรับปริมาณการเกิดปฏิกิริยาสุดท้ายของน้ำยา 50 ลิตร PCR รวม
18.5 ลิตร H2O ฟรี RNase และ DNase, 2.5 ลิตร 10 ×แรกยืน
บัฟเฟอร์ 3 ลิตร dNTPs (10 มิลลิเมตร) 0.75 ลิตร MgCl2 (ขนาด 50 มม), 0.25 L
ของ Taq DNA Polymerase (2.5 U / L Invitrogen) มีดังต่อไป
เงื่อนไขการขี่จักรยาน: 93 ◦Cเป็นเวลา 3 นาที 35 รอบ 93 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที 55 ◦C
เป็นเวลา 1 นาทีและ 72 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีด้วยการบ่มสุดท้าย 68 ◦Cสำหรับ
7 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR มาวิเคราะห์โดย gel electrophoresis บน
เจล agarose 1.5% โดยมี TBE บัฟเฟอร์และเจลที่ถูกย้อมด้วยสี
SYBR ปลอดภัยดีเอ็นเอเจลคราบ (Invitrogen) การแสดงของ 742-BP
วงดนตรีที่กำลังดำเนินการโดยใช้เอกสาร GEL 1000 เครื่องดนตรี.
Todetermine ไว ofthemethod เป็น PCR wasperformed
รวมทั้งเจือจางอนุกรม 10 เท่าของอาณานิคม recombinant ทำความสะอาด
ที่มีชิ้นส่วนของ VP6 ของ RVs-D ที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น
50 ng / L และความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 × 10-5 ng / L.
2.4 การโคลนและ SE

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 4 .ตามลําดับที่รายงานโดย trojnar et al . ( 2010 ) เฉพาะไพรเมอร์ที่ออกแบบเป้าหมายที่ยีนรหัสสำหรับvp6 โปรตีนของ rvs-d โดยใช้โปรแกรมเมอร์ระเบิดพร้อมที่ ncbi . ส่งต่อรองพื้นที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ คือ rd6f( 5- ggaggcgctgtcttcaattgcg-3) และย้อนกลับรองพื้นคือrd6r ( 5- tggccaatagtgtgtggcagct-3) ซึ่งได้แก่ขยายขนาดเป็น BP .การตรวจหาตัวอย่าง rvs-d RT-PCR ทำการในสองขั้นตอน เพื่อให้ได้สายพันธุ์ 3 ล. สกัด dsRNA คือเพิ่มคู่ของไพรเมอร์ ตามด้วย ( ในช่วง 5 นาที95 ◦ C และการแช่แข็งหลังจากนั้น ขั้นตอนแรกคือ ย้อนกลับถอดความออกมาโดยใช้ระดับเสียงสุดท้าย 25 ลิตร รวมทั้ง16.5 ล. H2O ฟรีและเลสตรวจหา ADNase 2.5 ลิตร 10 ×บัฟเฟอร์( Invitrogen ) 1 ลิตร dntps ( อืม Invitrogen 10 ) 0.75 ลิตรไอโซโทป( 50 มม. Invitrogen ) 0.25 ลิตร RT ( superscripttm II , 20u Invitrogen , )และ 0.5 ลิตรแต่ละ primer ( 20 มม. Invitrogen ) ปฏิกิริยาเป็น◦บ่มที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียสนาน 1 ชั่วโมงขั้นตอนที่สองคือแสดงโดยซึ่งดำเนินการโดยการเพิ่ม 25 ล. PCR เพื่อให้ตัวอย่างดีเอ็นเอเป็นเล่มสุดท้ายของปฏิกิริยา PCR สามารถรวม 50 ลิตร18.5 ล. H2O ฟรีและเลสตรวจหา ADNase 2.5 ลิตร 10 ×แรกที่ยืนบัฟเฟอร์ , 3 ลิตร dntps ( 10 มม. ) 0.75 ลิตรชุด ( 50 มม. ) , 0.25 ลิตรของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( 2.5 U / L , Invitrogen ) มีดังต่อไปนี้เงื่อนไขการขี่จักรยาน : 93 ◦ C เป็นเวลา 3 นาที 35 รอบ 93 ◦เป็นเวลา 1 นาที , 55 ◦ c1 นาที , และ 72 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที กับการบ่มเพาะ สุดท้ายที่ 68 ◦ C สำหรับ7 นาที การตรวจวิเคราะห์ โดยเจลบนผลิตภัณฑ์1.5 % เจลโรสกับทีบี บัฟเฟอร์ และเจลเปื้อนดีเอ็นเอเจล SYBR ปลอดภัยคราบ ( Invitrogen ) การแสดงของเป็น ความดันวงดนตรี ทำการศึกษาโดยใช้เจลหมอ 1000 เครื่องมือศึกษาความไวและ ofthemethod , ดีเอ็นเอรวม 10 พับต่อเนื่องวิธีการชำระแบบอาณานิคมที่ประกอบด้วยส่วนของ vp6 ของ rvs-d ที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น50 กรัม / ลิตรและที่ความเข้มข้นสุดท้าย 5 × 10 − 5 กรัม / ลิตร2.4 . การโคลนและเซ