To purify the recombinant proteins

To purify the recombinant proteins 3xFlag-ZNF224, 3xFlag-KAP1 and Myc-PRMT5, to be used for
in vitro methylation assay, anti-Flag M2 agarose beads and anti-c-Myc agarose conjugate (10 mL
beads/mg proteins, Sigma) were added to 10 mg of cell lysates, obtained with 50 mM Tris-HCl pH 8.0,
150 mM NaCl, 0.1% NP40, 10% glycerol, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mg/mL
aprotinin and 1 mg/mL pepstatin A; after incubation for 3 h at 4 °C, the immunoprecipitates were
rinsed with Wash Buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 10%
glycerol, 0.1% NP-40, 0.5 mM PMSF, 1 mg/mL aprotinin and 1 mg/mL pepstatin A), Cell Lysis
buffer, and Methylation Buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, protease inhibitors).
The recombinant proteins 3xFlag-ZNF224 and 3xFlag-KAP1 were competitively eluted from beads
by affinity chromatography using Pure Yield Binding Columns (Promega) and the peptide Flag
100 μg/mL (Sigma) in 50 μL of Methylation Buffer.
Also, to immunoprecipitate 3xFlag-ZNF224 and 3xFlag-KAP1 recombinant proteins to be used for
in vivo analysis of arginine methylation and coimmunoprecipitation experiments, 5 μg of anti-Flag
antibody (anti Flag-M2, Sigma) or 5 μg of IgG were added to 1mg of protein extract, precleared with
25 mL of A/G Plus Agarose (Santa Cruz) for 2 h. Immunoprecipitations were carried out overnight
at 4 °C. The immune complexes were collected with Protein A/G PLUS Agarose, washed with the lysis
buffer and loaded on a 8% SDS-PAGE for western blot analysis with anti-Flag (anti Flag-M2, Sigma,
1:5000 dilution), anti-KAP1 (Novus Biologicals, 1:1000 dilution), anti-SYM11 and anti-PRMT5
antibodies (Upstate, 1 mg/mL).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ต้องทำ recombinant โปรตีน 3xFlag-ZNF224, 3xFlag KAP1 และ Myc-PRMT5 ที่จะใช้สำหรับปรับเครื่องมือวิเคราะห์ ลูกปัด agarose M2 ธงต่อต้าน และป้องกัน-c-Myc agarose ค่าสังยุค (10 mLลูกปัด/มิลลิกรัมโปรตีน ซิก) ถูกเพิ่มเข้าไป 10 มก.ของเซลล์ lysates ได้ ด้วย 50 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 8.0มม. 150 NaCl, 0.1% NP40, 10% กลีเซอร ฟลูออไรด์ phenylmethylsulfonyl 0.5 mM (PMSF) 1 mg/mLaprotinin และ 1 mg/mL pepstatin A หลังจากฟักตัวใน h 3 ที่ 4 ° C, immunoprecipitates อยู่rinsed ด้วยล้างบัฟเฟอร์ (50 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 8.0, 300 มม. NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 10%กลีเซอร 0.1% NP-40, 0.5 mM PMSF, aprotinin 1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และ 1 mg/mL pepstatin A), เซลล์ Lysisบัฟเฟอร์ และปรับบัฟเฟอร์ (50 mM 1 mM EDTA, 1 มม. EGTA รติเอส inhibitors, TrisHCl)Recombinant โปรตีน 3xFlag ZNF224 และ 3xFlag KAP1 สามารถแข่งขันได้ eluted จากลูกปัดโดยความสัมพันธ์ chromatography ใช้บริสุทธิ์อัตราผลตอบแทนผูกคอลัมน์ (Promega) และเพปไทด์ธง100 μg/mL (ซิกมา) ใน μL 50 ปรับบัฟเฟอร์ไปยัง immunoprecipitate 3xFlag-ZNF224 และ 3xFlag KAP1 recombinant โปรตีนจะใช้สำหรับในสัตว์ทดลองวิเคราะห์ปรับอาร์จินีน และทดลอง coimmunoprecipitation, μg 5 ของธงต่อต้านแอนติบอดี (ป้องกันธง-M2 ซิก) หรือ μg 5 ของ IgG เพิ่มเข้า 1 มก.สารสกัดจากโปรตีน precleared ด้วย25 mL ของ A/G บวก Agarose (ซานตาครูซ) สำหรับ 2 h. Immunoprecipitations ได้ดำเนินการค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส สิ่งอำนวยความสะดวกภูมิคุ้มกันถูกเก็บรวบรวม ด้วย Agarose โปรตีน A/G PLUS ล้าง ด้วยการ lysisบัฟเฟอร์ และโหลดบน 8% SDS-หน้าตะวันตกทำลายวิเคราะห์ ด้วยค่าสถานะป้องกัน (ป้องกันธง-M2 ซิก1:5000 เจือจาง), ต่อต้าน-KAP1 (โนวัส Biologicals, 1:1000 เจือจาง), SYM11 ป้องกัน และต่อต้าน-PRMT5แอนตี้ (เขตเหนือของรัฐ 1 mg/mL)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการชำระล้างโปรตีน 3xFlag-ZNF224, 3xFlag-KAP1 และ-Myc PRMT5 ที่จะใช้สำหรับการ
ทดสอบในหลอดทดลอง methylation, M2 ต่อต้านธงประจำลูกปัด agarose และ anti-C-Myc ผัน agarose (10 มล
ลูกปัด / มิลลิกรัมโปรตีนซิก) ถูกเพิ่มถึง 10 มิลลิกรัมของ lysates เซลล์รับกับ 50 มิลลิเมตร Tris-HCl พีเอช 8.0,
150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 0.1% NP40, กลีเซอรีน 10%, 0.5 มิลลิฟลูออไร phenylmethylsulfonyl (PMSF) 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร
Aprotinin ถึง 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร pepstatin ; หลังจากบ่มนาน 3 ชั่วโมงที่ 4 ° C, immunoprecipitates ถูก
ล้างด้วยล้างบัฟเฟอร์ (50 มิลลิเมตรค่า pH Tris-HCl 8.0, 300 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1 มิลลิ EDTA พีเอช 8.0, 10%
กลีเซอรอล, 0.1% NP-40, 0.5 มิลลิ PMSF, 1 mg / ml Aprotinin ถึง 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร pepstatin) มือ Lysis
บัฟเฟอร์และ Methylation บัฟเฟอร์ (50 มิลลิ TrisHCl, EDTA 1 มิลลิ, 1 มิลลิ EGTA, น้ำย่อย).
โปรตีน 3xFlag-ZNF224 และ 3xFlag-KAP1 มีการแข่งขัน ชะจากลูกปัด
โดยโครมาเป็นพี่น้องกันโดยใช้คอลัมน์เข้าเล่มผลผลิตบริสุทธิ์ (Promega) และเปปไทด์ธงประจำ
100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (Sigma) ใน 50 ไมโครลิตรของ Methylation บัฟเฟอร์.
นอกจากนี้เพื่อ immunoprecipitate 3xFlag-ZNF224 และ 3xFlag-KAP1 โปรตีนที่จะใช้สำหรับ
ใน การวิเคราะห์ร่างกายของ methylation arginine และการทดลอง coimmunoprecipitation 5 ไมโครกรัมต่อต้านธงประจำ
แอนติบอดี (anti-M2 ธงประจำซิก) หรือ 5 ไมโครกรัมของ IgG ถูกเพิ่มเข้าไปใน 1 มิลลิกรัมของสารสกัดจากโปรตีน precleared กับ
25 มิลลิลิตร / G พลัส Agarose (Santa Cruz ) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง immunoprecipitations ได้ดำเนินการในชั่วข้ามคืน
ที่ 4 ° C คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันถูกเก็บรวบรวมด้วยโปรตีน / G PLUS Agarose ล้างด้วยสลาย
บัฟเฟอร์และโหลดใน 8% SDS-PAGE สำหรับการวิเคราะห์ดวงตะวันที่มีการป้องกันธง (ธงต่อต้าน M2, Sigma,
1: 5000 เจือจาง), การป้องกัน -KAP1 (Novus Biologicals, 1: 1000 เจือจาง), การป้องกัน SYM11 และ anti-PRMT5
แอนติบอดี (ตอนเหนือของมลรัฐ 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บริสุทธิ์โปรตีนรีคอมบิแนนท์ 3xflag-znf224 3xflag-kap1 myc-prmt5 , และ , ที่จะใช้ในหลอดทดลองจาก
โดยป้องกันธง M2 , ลูกปัดและ anti-c-myc , ผัน ( ลูกปัด / มก. 10 ml
โปรตีนซิกม่า ) เพิ่ม 10 มก. เซลล์ lysates ได้กับ 50 มม. โดย HCl pH 8.0 ,
โซเดียมคลอไรด์ 150 มม. 0.1% np40 10% , กลีเซอรอล , ฟลูออไรด์ phenylmethylsulfonyl 0.5 มม. ( PMSF )
1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรโพรทินินและ 1 mg / ml pepstatin ; หลังจากบ่มเป็นเวลา 3 ชม. ที่ 4 ° C , immunoprecipitates ถูก
ล้างบัฟเฟอร์ซัก ( จาก 50 mm กรดไฮโดรคลอริก pH 8.0 , เกลือ , 300 มม. 1 mM EDTA pH 8.0 , 10 %
% np-40 PMSF กลีเซอรอล , 0.1 , 0.5 มม. , 1 mg / ml และโพรทินิน 1 mg / ml pepstatin ) , การสลายเซลล์
บัฟเฟอร์ และจากบัฟเฟอร์ ( trishcl 50 มม. 1 mM EDTA 1 มม. หน่วยโปรตีเอสอินฮิบิเตอร์
, )