BALB/c mice (females, 6 weeks of ag

BALB/c mice (females, 6 weeks of age; Charles River Laboratories) were
30 subcutaneously injected with 400 ttL ฮิวเมน CD134-transfected Sf9 insect cell
lysates (250 µL cell lysate aliquot + 250 µL Complete Freund's adjuvant; Sigma) on Day 0. Similar subcutaneous injections using ฮิวเมน CD134-transfected Sf9 insect cell lysates and Incomplete Freund's adjuvant (Sigma) were given on Day 21 and


Day 42. Intraperitoneal booster injections with ฮิวเมน CD134-transfected Sf9
insect cell lysates (250 !IL/mouse) without adjuvant were given on Day 61 and on
Day 62. On day 65, splenocytes from immunized mice were fused with SP2/0
myeloma cells (DSMZ) using standard hybridoma technology initially described by 5 Kohler and Milstein (Nature 1975; 256: p495-497). Briefly, immunized mice were
sacrificed. Splenocytes were teased from spleens, and washed in serum-free opti-
MEM I with GlutaMax medium (SF medium; Invitrogen). Logarithmically growing
SP2/0-Ag14 myeloma cells were washed in SF medium, and added to the
splenocytes yielding a 5:1 ratio of splenocytes to myeloma cells. The cells were then 10 pelleted, and the supernatant was removed. One ml of a 37% (v/v) สารละลาย of
polyethylene glycol 4000 (Merck) was then added dropwise over a 60 sec period,
after which the cells were incubated for another 60 sec at 37°C. Eight ml SF
medium, followed by 5 ml opti-MEM I with GlutaMax/10% (v/v) fetal calf serum
(FCS; Bodinco), was then slowly added with gentle agitation. After 30 minutes at 15 RT, the cells were pelleted, washed in opti-MEM I with GlutaMax/10% FCS to
remove residual polyethylene glycol, and finally plated at a concentration of 105
cells/200 pi per well in opti-MEM I with GlutaMax/10% FCS/50x Hybri-MaxTM
aminopterin (de novo DNA synthesis inhibitor; Sigma). From day 7, aminopterin
selection medium was replenished every 2-3 days, and at day 14 it was replaced by 20 opti-MEM I with GlutaMax/10% FCS. Hybridomas, which produced antibodies
(mouse IgG class) against ฮิวเมน CD134 (screened with conventional ELISA and
flow cytometric techniques using a รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fey fusion
protein (R&D Systems; see Example 11 (a) below) and ฮิวเมน CD134 expressing
PHA (Roche)-stimulated CD4 T cell blasts (see Example 2 (a) below) as targets, 25 ตามลำดับ) were expanded, cryopreserved, and subcloned by limiting dilution.
แอนติ-ฮิวเมน CD134 specific โมโนโคลนอล antibodies were purified using protein G
columns (GE Healthcare), and resulted in mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibodies clone 12H3 and clone 20E5.


30 Example 2. Flow cytometric characterization of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5


(a). CD134 expression on PHA-stimulated ฮิวเมน T ลิมโฟไซต์
ฮิวเมน peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors (informed consent) were isolated by density centrifugation on Lymphoprep (1.077 g/mL; Nycomed). Subsequently, 1-2x106 PBMC/mL in RPMI-1640 culture medium
(Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50 Rg/mL gentamycin (Gibco) 5 were stimulated with 0, 0.1, 1.0 หรือ 10.0 pig/mL phytohemagglutinin-M (PHA-M;
Roche) at 37°C/5% CO2 for 1-3 days. After culture, PBMC were harvested and put
at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled phosphate-buffered saline containing 0.1% bovine
serum albumin (Sigma)/0.05% NaN3 (PBS/BSA/NaN3) supplemented with 10%
ฮิวเมน pooled serum (HPS; blocking Fcy รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were
10 incubated with 10 lighnL commercially available mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone ACT35 (mouse IgG1 ไอโซไทป์; BD Biosciences, Alphen aan de Rijn,
The Netherlands) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:200 diluted PE-
conjugated goat แอนติ-mouse IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30
15 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated
with 1:20 diluted ฟลูออเรสซีน isothiocyanate (FITC) conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD3 antibody (BD Biosciences) to detect T ลิมโฟไซต์ for 30 minutes at 4°C.
After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in
PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using 20 flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

As shown in รูป 1 (n=1 from each donor), peripheral blood-derived non-
stimulated/resting ฮิวเมน T ลิมโฟไซต์ did not express any CD134, however,
PHA dose-dependently stimulated ฮิวเมน CD3P°sitive T ลิมโฟไซต์ to express
25 surface CD134. When exposed to 10 gg/mL PHA, CD134 expression levels on
activated ฮิวเมน CD3P°sitive T ลิมโฟไซต์ seemed to reach a plateau between 'day
1' and 'day 2', however, the percentage of ฮิวเมน CD134Positive/CD3positive
ลิมโฟไซต์ time-dependently increased during experimentation.


30 (b). CD134 expression on PHA-stimulated ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์
subpopulation
PHA-stimulated (at 0 and 10 lig/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
cells/mL in ice chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 10% HPS (blocking Fcy รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were incubated with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) หรือ 1:10 diluted FITC-conjugated
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD8 antibody (BD Biosciences) in combination with 1:10 5 diluted commercially available PE conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 clone
ACT35 (BD Biosciences) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/Nan for 30
minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using flow cytometry
(FACSCalibur; BD Biosciences).
10
As shown in รูป 2, CD134 expression was observed on PHA-stimulated
ฮิวเมน CD4Positive T ลิมโฟไซต์ and not on resting ฮิวเมน CD4Positive
ลิมโฟไซต์. Low CD134 expression was found on PHA-activated ฮิวเมน CD8P0sitive T ลิมโฟไซต์ and not on resting ฮิวเมน CD8positive T ลิมโฟไซต์ (data not
15 shown).

(c). Binding of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3
and 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 p.g/mL for 2 days; see above) ฮิวเมน CD134 expressing T 20 ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in
ice chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 10% HPS (blocking Fcy รีเซปเตอร์;
BioWhittaker). Cells were incubated with 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6,
16.7, 50.0 p,g/mL commercially available mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
ACT35 (mouse IgG1 ไอโซไทป์; BD Biosciences) and mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
25 antibody clone 12H3 หรือ clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After extensive washing
in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:200 diluted PE-
conjugated goat แอนติ-mouse IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30
minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated
with 1:20 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3 antibody (BD
30 Biosciences) to detect T ลิมโฟไซต์ for 30 minutes at 4°C. After extensive
washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/Nan
for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using flow cytometry
(FACSCalibur; BD Biosciences).
As shown in รูป 3 (mean 1 SD; results observed in two donors), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35, clone 12H3, and clone 20115 saturated ฮิวเมน CD134 surface molecules on PHA-stimulated CD3P0sitive T ลิมโฟไซต์ at
approximately 5.0-10.0 gg/mL. Using these two donors, half maximal binding was 5 observed at = 0.5 pg/mL for mouse anti ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3, and at
c--=,2.5 i.g/mL for mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35 and clone 20E5.
(d). Binding of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 positive and CD8
10 positive T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 20 i.tg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 10% HPS (blocking Fcy
รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were incubated with 20.014/mL mouse IgGlx
15 ไอโซไทป์ control (BD Biosciences), หรือ with 20.0 i.tg/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After
extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:100
diluted PE-conjugated goat แอนติ-mouse IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch)
for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were
20 incubated for 30 minutes at 4°C with 1:20 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) หรือ with 1:20 diluted FITC-conjugated mouse
แอนติ-ฮิวเมน CD8 antibody (BD Biosciences) to detect T ลิมโฟไซต์ subpopulations.
After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in
PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using 25 flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หนู BALB/c (เพศหญิง อายุ 6 สัปดาห์ แม่น้ำชาร์ล Laboratories) ได้30 subcutaneously ฉีด ด้วย 400 ttL ฮิวเมน CD134 transfected Sf9 แมลงเซลล์lysates (250 µL เซลล์ lysate ส่วนลงตัว + 250 µL สมบูรณ์ Freund ของประเมิน ซิกมา) ในวันที่ 0 ฉีดใต้คล้ายกันที่ใช้ lysates ฮิวเมน CD134 transfected Sf9 เซลล์แมลงและประเมินสมบูรณ์ Freund (ซิกมา) ที่ได้รับในวันที่ 21 และวัน 42 บูสเตอร์ intraperitoneal ฉีดกับฮิวเมน CD134 transfected Sf9lysates เซลล์แมลง (250 IL/mouse) โดยไม่ต้องประเมินได้รับ 61 วัน และใน 62 วัน ในวันที่ 65, splenocytes จากหนู immunized ถูก fused กับ SP2/0 เซลล์ myeloma (DSMZ) โดยใช้เทคโนโลยีมาตรฐาน hybridoma เริ่มอธิบาย 5 โคห์เลอร์และ Milstein (ธรรมชาติ 1975; 256: p495-497) สั้น ๆ immunized หนูได้ เสียสละ Splenocytes teased จาก spleens และล้างในซีรั่มฟรี opti- หน่วยความจำผม ด้วย GlutaMax ปานกลาง (SF medium Invitrogen) เติบโตแบบลอการิทึม เซลล์ myeloma SP2/0-Ag14 ถูกล้างใน SF และเพิ่มการ splenocytes ผลผลิต 5:1 อัตราส่วนของ splenocytes เซลล์ myeloma เซลล์ได้แล้ว 10 pelleted และ supernatant ถูกเอาออก Ml หนึ่งของสารละลาย 37% (v/v) ของpolyethylene glycol 4000 (เมอร์ค) แล้วเพิ่ม dropwise ช่วงระยะเวลา 60 วินาที หลังจากที่เซลล์ถูก incubated สำหรับอีก 60 วินาทีที่ 37 องศาเซลเซียส 8 ml SF กลาง ตาม ด้วย 5 ml opti-หน่วยความจำผม ด้วยเซรั่มลูกครรภ์ GlutaMax/10% (v/v) (FCS ช้าแล้วมีเพิ่ม Bodinco), มีอาการกังวลต่อเบา ๆ หลังจาก 30 นาทีที่ 15 RT เซลล์ได้ pelleted ล้างใน opti-หน่วยความจำผม ด้วย GlutaMax/10% FCS การ เอาเหลือ polyethylene glycol และสุดท้าย ชุบที่ความเข้มข้น 105 เซลล์ 200 พายต่อดีใน opti-หน่วยความจำผม ด้วย GlutaMax/10% FCS/50 x Hybri-MaxTM aminopterin (de novo ดีเอ็นเอสังเคราะห์สารยับยั้ง ซิกมา) วัน 7, aminopterin เลือกสื่อถูกเติมทุก 2-3 วัน และในวันที่ 14 มันถูกแทนที่ ด้วย opti-หน่วยความจำ 20 ฉันกับ GlutaMax/10% FCS Hybridomas การผลิตแอนตี้ (เมาส์คลาส IgG) กับฮิวเมน CD134 (ฉายกับ ELISA ธรรมดา และ เทคนิค cytometric กระแสใช้ฟิวชั่น CD134:ฮิวเมน Fey ฮิวเมนรีคอมบิแนนต์ โปรตีน (R & D ระบบ ดูตัวอย่างที่ 11 (a) ด้านล่าง) และการแสดงฮิวเมน CD134 ผา (Roche) -เซลล์ CD4 T ขาวกระตุ้น blasts (ดู (a) 2 ตัวอย่างด้านล่าง) เป็นเป้าหมาย 25 ตามลำดับ) ขยาย cryopreserved และ subcloned จำกัดเจือจาง แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลเฉพาะแอนตี้ได้บริสุทธิ์โดยใช้โปรตีน G คอลัมน์ (GE สุขภาพ), และเมาส์ให้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอล แอนตี้ 12H 3 โคลน และโคลน 20E530 ตัวอย่าง 2 ขั้นตอนการ cytometric คุณสมบัติของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134แอนตี้โมโนโคลนอล clones 12H 3 และ 20E5(ก) การนิพจน์ CD134 การถูกกระตุ้นผาฮิวเมน T ลิมโฟไซต์ฮิวเมนพ่วง mononuclear เม็ดเลือด (PBMC) จากผู้บริจาคเพื่อสุขภาพ (แจ้งความยินยอม) ได้แบ่งแยก centrifugation ความหนาแน่นบน Lymphoprep (1.077 g/mL Nycomed) ในเวลาต่อมา 1-2 x PBMC 106 mL ใน RPMI 1640 วัฒนธรรมลูกและทารกในครรภ์ (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่ม (Bodinco) และ 50 มล./Rg gentamycin (Gibco) 5 ได้ถูกกระตุ้น ด้วย 0, 0.1, 1.0 หรือหมู 10.0 mL phytohemagglutinin-M (ผา-M โรช) ที่ 37°C/5% CO2 1-3 วัน หลังจากวัฒนธรรม PBMC ได้เก็บเกี่ยวผลผลิต และใส่ ที่ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่น้ำเกลือฟอสเฟต buffered ประกอบด้วย 0.1% วัว serum albumin (Sigma)/0.05% NaN3 (PBS/บี เอส เอ/NaN3) เสริม ด้วย 10% ฮิวเมนทางถูกพูเซรั่ม (HPS; Fcy บล็อกรีเซปเตอร์ BioWhittaker) เซลล์ได้ 10 incubated กับ lighnL ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ 10 เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน ACT35 (เมาส์ IgG1 ไอโซไทป์ เวลาออก BD อัลเฟนวิกอาน de Rijn เนเธอร์แลนด์) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 200 ทำให้ PE - แพะที่กลวงแอนติ-เมาส์ IgG แอนตี้ (Jackson ImmunoResearch) สำหรับ 30 15 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated กับ 1:20 ฟลูออเรสซีนแตกออก isothiocyanate (FITC) กลวงเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD3 แอนติบอดี (เวลาออก BD) ตรวจพบ T ลิมโฟไซต์ 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ถูกวัดโดยใช้เซลล์กระแส 20 (FACSCalibur BD เวลาออก)ดังแสดงในรูปที่ 1 (n = 1 จากผู้บริจาคแต่ละ), อุปกรณ์ต่อพ่วงที่ได้รับเลือดไม่ ฮิวเมน T ลิมโฟไซต์ถูกกระตุ้น/พักผ่อนได้ไม่ด่วน CD134 ใด ๆ แต่ ถูกกระตุ้นฮิวเมน CD3P ° sitive T ลิมโฟไซต์แสดงผายา-dependently 25 ผิว CD134 เมื่อสัมผัสกับ gg 10 มลผา นิพจน์ CD134 ระดับบน เปิดฮิวเมน CD3P ° sitive T ลิมโฟไซต์ประจักษ์ถึงราบสูงระหว่าง ' วัน 1' และ ' วัน 2' อย่างไร ตามเปอร์เซ็นต์ของฮิวเมน CD134Positive/CD3positive ลิมโฟไซต์เวลา-dependently เพิ่มขึ้นในระหว่างการทดลอง30 (b) CD134 นิพจน์การถูกกระตุ้นผาฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์subpopulationถูกกระตุ้นผา (ที่ 0 และ lig 10 mL 1 วัน ดูข้างต้น) ฮิวเมน CD134T ลิมโฟไซต์กำลังถูกสร้างขึ้น เก็บเกี่ยวผลผลิต และใส่ 1-2 x 106 เซลล์เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เสริม ด้วย 10% HPS (บล็อก Fcy รีเซปเตอร์ BioWhittaker) เซลล์ถูก incubated กับ 1:10 ทำให้เมาส์ FITC กลวงแอนติฮิวเมน CD4 แอนติบอดี (เวลาออก BD) หรือ 1:10 ทำให้ FITC กลวงแอนติบอดี CD8 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ (เวลาออก BD) ร่วมกับ 1:10 5 ผสม PE ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์กลวงเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โคลน ACT35 (เวลาออก BD) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS บีเอสเอ/น่านสำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ถูกวัดโดยใช้เซลล์กระแส (FACSCalibur BD เวลาออก)10ดังแสดงในรูป 2, CD134 นิพจน์ถูกสังเกตบนผาถูกกระตุ้นฮิวเมน CD4Positive T ลิมโฟไซต์ และไม่วางตัวฮิวเมน CD4Positiveลิมโฟไซต์ พบนิพจน์ CD134 ต่ำเรียกผาฮิวเมน CD8P0sitive T ลิมโฟไซต์ และไม่วางตัวฮิวเมน CD8positive T ลิมโฟไซต์ (ข้อมูลไม่15 แสดง)(ค) การผูกของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 ในฮิวเมนผาถูกกระตุ้น CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์ ถูกกระตุ้นผา (ที่ 10 p.g/mL 2 วัน ดูข้างต้น) ฮิวเมน CD134 แสดง T 20 ลิมโฟไซต์สร้างขึ้น เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในเซลล์ น้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เสริม ด้วย 10% HPS (บล็อก Fcy รีเซปเตอร์ BioWhittaker) เซลล์ถูก incubated 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.616.7, 50.0 p, g/mL เมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน ACT35 (เมาส์ IgG1 ไอโซไทป์ เวลาออก BD) และเมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมน แอนติบอดีที่ 25 โคลน 12H 3 หรือโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 200 ทำให้ PE -แพะที่กลวงแอนติ-เมาส์ IgG แอนตี้ (Jackson ImmunoResearch) สำหรับ 30นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated กับ 1:20 ทำให้เมาส์ FITC กลวงแอนติฮิวเมน CD3 แอนติบอดี (BD เวลาออก 30) ตรวจพบ T ลิมโฟไซต์ 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากอ่านรีวิว ซักผ้าใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS บีเอสเอ/น่าน 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ถูกวัดโดยใช้เซลล์กระแส (FACSCalibur BD เวลาออก)ดังแสดงในรูปที่ 3 (ค่าเฉลี่ย 1 SD ผลลัพธ์ในสองผู้บริจาค), เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน ACT35 โคลน 12H 3 และโคลน 20115 ฮิวเมนอิ่มตัว CD134 ผิวโมเลกุลบนผาถูกกระตุ้น T CD3P0sitive ลิมโฟไซต์ที่ประมาณ 5.0-10.0 gg/mL ใช้ผู้บริจาคเหล่านี้สอง ผูกครึ่งสูงสุด 5 สังเกตที่ = 12H 3 โคลน pg 0.5 mL สำหรับเมาส์ต่อต้านแอนติบอดี CD134 ฮิวเมน และที่ c--= i.g/mL 2.5 สำหรับเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ACT35 และโคลน(d) การผูกของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 ฮิวเมนผาถูกกระตุ้น CD134 แสดง CD4 บวกและ CD8T ลิมโฟไซต์บวก 10ถูกกระตุ้นผา (ที่ i.tg/mL 20 1 วัน ดูข้างต้น) ฮิวเมน CD134T ลิมโฟไซต์กำลังถูกสร้างขึ้น เก็บเกี่ยวผลผลิต และใส่ 1-2 x 106 เซลล์ เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เสริม ด้วย 10% HPS (Fcy การบล็อค รีเซปเตอร์ BioWhittaker) เซลล์มี incubated กับ 20.014/mL เมาส์ IgGlx 15 ไอโซไทป์ควบคุม (เวลาออก BD) หรือ มี 20.0 i.tg/mL เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมน โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 หรือโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก อย่างละเอียดซักผ้าใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 100 ทำให้แอนตี้ IgG แอนติ-เมาส์แพะ PE กลวง (Jackson ImmunoResearch) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้ 20 incubated 30 นาทีที่ 4° C มี 1:20 ทำให้เมาส์ FITC กลวงแอนติ - หรือแอนติบอดี (เวลาออก BD) CD4 ฮิวเมนกับ 1:20 ทำให้เมาส์ FITC กลวง แอนติ-ฮิวเมน CD8 แอนติบอดี (เวลาออก BD) สืบ T ลิมโฟไซต์ subpopulations หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ถูกวัดโดยใช้กระแส 25 เซลล์ (FACSCalibur BD เวลาออก)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หนู Balb / c (หญิง 6 สัปดาห์บริบูรณ์เสต) เป็น
30 เข้าใต้ผิวหนังฉีด 400 TTL ฮิวเมน CD134-transfected เซลล์แมลง Sf9
lysates (250 ไมโครลิตรเซลล์ lysate aliquot + 250 ไมโครลิตรที่สมบูรณ์แบบเสริมของ Freund; ซิกม่า) ในวัน 0. ฉีดใต้ผิวหนังที่คล้ายกันโดยใช้ฮิวเมน CD134-transfected lysates เซลล์แมลง Sf9 และเสริมที่ไม่สมบูรณ์ของ Freund (ซิกม่า) ที่ได้รับในวันที่ 21 และวันที่42 สนับสนุนการฉีดสารที่มีฮิวเมน CD134-transfected Sf9 lysates เซลล์แมลง (250! อิลลินอยส์ / mouse) โดยไม่ต้องเสริมที่ได้รับในวันที่ 61 และ62 วันในวันที่ 65, splenocytes จากหนูสร้างภูมิต้านทานได้รับการผสมกับ SP2 / 0 เซลล์ myeloma (DSMZ) โดยใช้เทคโนโลยีไฮบริมาตรฐานที่อธิบายไว้ในขั้นแรกโดย 5 โคห์เลอร์และ Milstein (เนเจอร์ 1975; 256 : p495-497) สั้น ๆ , หนูวัคซีนได้รับการเสียสละ Splenocytes ถูกแกล้งจากม้ามและล้างในซีรั่มฟรีเหมาะสมที่สุดMEM ฉันกับสื่อ GlutaMax (เอสเอฟขนาดกลาง Invitrogen) ลอการิทึมการเติบโตSP2 / 0 Ag14 เซลล์ myeloma ถูกล้างในระยะกลางเอสเอฟและเพิ่มเข้าไปในsplenocytes ยอม 5: 1 อัตราส่วนของ splenocytes ไปยังเซลล์ myeloma เซลล์มี 10 เม็ดและใสจะถูกลบออก หนึ่งมิลลิลิตร 37% (v / v) สารละลายของพลาสติกคอล4000 (เมอร์ค) ถูกบันทึกแล้ว dropwise ในช่วงระยะเวลา 60 วินาทีหลังจากที่เซลล์ถูกบ่มอีก60 วินาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แปดมล. เอสเอฟกลางตามด้วย5 มล. Opti-MEM ฉันกับ GlutaMax / 10% (v / v) ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว(FCS; Bodinco) จากนั้นก็เพิ่มช้าด้วยความปั่นป่วนอ่อนโยน หลังจาก 30 นาทีที่ 15 อาร์เซลล์ที่ถูกเม็ดล้างใน Opti-MEM ฉันกับ GlutaMax / 10% FCS จะเอาพลาสติกคอลที่เหลือและชุบที่สุดที่มีความเข้มข้น105 เซลล์ / 200 ปี่ต่อดีใน Opti-MEM ฉันด้วย GlutaMax / 10% FCS / 50x-Hybri MaxTM aminopterin (โนโวยับยั้งการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ; ซิกม่า) ตั้งแต่วันที่ 7 aminopterin กลางเลือกที่ได้รับการเติมเต็มทุก 2-3 วันและในวันที่ 14 มันถูกแทนที่ด้วย 20 Opti-MEM ฉันกับ GlutaMax / 10% FCS ไฮบริซึ่งผลิตแอนติบอดี(ชั้น IgG เมาส์) กับฮิวเมน CD134 (คัดกรองด้วยวิธี ELISA ธรรมดาและไหลเทคนิคcytometric ใช้รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนฟิวชั่นชอบกลโปรตีน(R & D ระบบดูตัวอย่าง 11 (ก) ด้านล่าง) และฮิวเมน CD134 แสดงPHA (Roche) -stimulated CD4 T หนเซลล์ (ดูตัวอย่างที่ 2 (ก) ด้านล่าง) เป็นเป้าหมาย 25 ตามลำดับ) ได้รับการขยายแช่แข็งและ subcloned โดยการ จำกัด การลดสัดส่วน. แอน ติ - ฮิวเมน CD134 เฉพาะโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้โปรตีน G คอลัมน์ (GE Healthcare) และส่งผลให้เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและโคลน12H3 20E5. 30 ตัวอย่างที่ 2 ลักษณะการไหลของ cytometric เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 (ก) การแสดงออกของ CD134 ใน PHA กระตุ้นฮิวเมน T มโฟลิไซต์ฮิวเมนเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์(PBMC) จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี (ความยินยอม) ที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงหนาแน่นใน Lymphoprep (1.077 กรัม / มิลลิลิตร; Nycomed) ต่อมา 1-2x106 PBMC / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI-1640 (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว (Bodinco) และ 50 Rg / mL Gentamycin (Gibco) 5 ถูกกระตุ้นด้วย 0, 0.1, 1.0 หรือ 10.0 หมู / mL phytohemagglutinin -M (PHA-M; Roche) ที่ 37 ° C / CO2 5% สำหรับ 1-3 วัน หลังจากวัฒนธรรม PBMC เก็บเกี่ยวและใส่ที่1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1% วัวอัลบูมิซีรั่ม(ซิกม่า) /0.05% NaN3 (พีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3) เสริมด้วย 10% ฮิวเมน พูเซรั่ม (HPS; ปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker) เซลล์ที่ถูก10 บ่ม 10 lighnL เมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน ACT35 (เมาส์ IgG1 ไอโซไทป์; BD ชีววิทยาศาสตร์ Alphen อานเดอ Rijn, เนเธอร์แลนด์) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 1: 200 ปรับลด PE- แพะผันแอนติ -mouse แอนติบอดี IgG (แจ็คสัน ImmunoResearch) 30 15 นาทีที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ1:20 เจือจางฟลูออเรสซีน isothiocyanate (FITC) เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีCD3 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ 30 นาทีที่ 4 ° C. หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส/ บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟ 20. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์) ดังแสดงในรูปที่ 1 (n = 1 จากกันบริจาค) อุปกรณ์ต่อพ่วงเลือดที่ได้มาไม่ใช่การกระตุ้น/ พักผ่อนฮิวเมนทีลิมโฟไซต์ไม่ได้แสดง CD134 ใด ๆ แต่PHA ยา dependently กระตุ้นฮิวเมน CD3P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ที่จะแสดง25 พื้นผิว CD134 เมื่อสัมผัสกับ 10 GG / mL PHA, CD134 ระดับการแสดงออกในการเปิดใช้งานฮิวเมนCD3P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ดูเหมือนจะถึงที่ราบระหว่าง 'วันที่1' และ 'วันที่ 2' แต่ร้อยละของฮิวเมน CD134Positive / CD3positive ลิมโฟไซต์เวลา dependently เพิ่มขึ้นในช่วงการทดลอง. 30 (ข) การแสดงออกของ CD134 ใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD4 ทีลิมโฟไซต์subpopulation PHA กระตุ้น (ที่ 0 และ 10 lig / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วย HPS 10% (การปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 1:10 เจือจางเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) หรือ 01:10 เจือจาง FITC-ผันเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดี CD8 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ร่วมกับ 01:10 5 เจือจางใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ PE ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนACT35 (BD ชีววิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / น่าน 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้ cytometry ไหล(FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). 10 ดังแสดงในรูปที่ 2 การแสดงออก CD134 เป็นข้อสังเกตเกี่ยวกับ PHA กระตุ้นฮิวเมนCD4Positive ทีลิมโฟไซต์และไม่ได้อยู่ในการพักผ่อนฮิวเมน CD4Positive ลิมโฟ ไซต์ การแสดงออกของ CD134 ต่ำถูกพบอยู่ PHA เปิดใช้งานฮิวเมน CD8P0sitive ทีลิมโฟไซต์และไม่ได้อยู่ในการพักผ่อนฮิวเมน CD8positive ทีลิมโฟไซต์ (ข้อมูลไม่ได้15 แสดง). (ค) ผูกเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์PHA กระตุ้น (10 pg / มิลลิลิตรสำหรับ 2 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดง T 20 ลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นพีบีเอส/ บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วย HPS 10% (การปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 พี, กรัม / มิลลิลิตรเมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 ACT35 (เมาส์ IgG1 ไอโซไทป์; BD ชีววิทยาศาสตร์) และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 25 แอนติบอดีโคลน 12H3 หรือโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 1: 200 ปรับลด PE- แพะผันแอนติ -mouse แอนติบอดี IgG (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ1:20 เจือจางเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD3 (BD 30 ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส . หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / น่าน 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟ. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์) ดังแสดงในรูปที่ 3 (หมายถึง 1 SD ผลลัพธ์ที่สังเกตได้ในสองผู้บริจาค) เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 ACT35 โคลน 12H3 และโคลน 20,115 อิ่มตัวฮิวเมนโมเลกุล CD134 พื้นผิวบน PHA กระตุ้น CD3P0sitive ทีลิมโฟไซต์ที่ประมาณ5.0-10.0 GG / มิลลิลิตร ใช้ทั้งสองบริจาคครึ่งหนึ่งผูกพันสูงสุด 5 ข้อสังเกตที่ = 0.5 pg / มิลลิลิตรสำหรับเมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และในค- = 2.5 ig / มิลลิลิตรสำหรับเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลนและโคลน ACT35 20E5. (ง) ผูกเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 และ CD8 บวก10 บวกทีลิมโฟไซต์PHA กระตุ้น (ที่ 20 i.tg/ มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วย HPS 10% (การปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 20.014 / mL เมาส์ IgGlx 15 ไอโซไทป์ควบคุม (BD ชีววิทยาศาสตร์) หรือด้วยเมาส์ 20.0 i.tg/mL แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือโคลน 20E5 เป็นเวลา 30 นาที ที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 1: 100 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ -mouse แอนติบอดี IgG (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูก20 บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส 01:20 เจือจางเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) หรือที่มีการปรับลด FITC 01:20 เมาส์ -conjugated แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD8 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ประชากร. หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส/ บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟ 25 (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หนูสายพันธุ์ Balb / C ( ชาย 6 สัปดาห์ของอายุ ห้องปฏิบัติการ Charles River )
30 subcutaneously ฉีด 400 TTL ฮิวเมน cd134 transfected แมลงเซลล์
lysates ( 250 µและ lysate ส่วนลงตัว 250 µผมสมบูรณ์ Freund เป็นผู้ช่วย ; Sigma ) ในวัน 0ที่คล้ายกันใต้ผิวหนังฉีดใช้ฮิวเมน cd134 transfected แมลงและเซลล์ lysates สมบูรณ์ Freund เป็นผู้ช่วย ( Sigma ) ได้รับในวัน 21


วัน 42 การฉีดเข้าช่องท้อง Booster กับฮิวเมน cd134 transfected เซลล์แมลงต่างๆ
lysates ( 250 ! อิล / เมาส์ ) โดยไม่มีผู้ช่วยที่ได้รับในวัน 61 และ 62 วัน
. ในวัน 65 ,การเติบโตทางเศรษฐกิจจากการฉีดหนูผสมกับ SP2 / 0
การพัฒนาเซลล์ ( dsmz ) โดยใช้มาตรฐาน hybridoma เทคโนโลยีเริ่มอธิบาย โดย 5 บริษัท มิลสไตน์ ( ธรรมชาติและ 1975 ; 256 : p495-497 ) สั้น ๆ , กลุ่มหนู
บูชายัญ การเติบโตทางเศรษฐกิจถูกแกล้งจากม้าม และล้างใน serum-free OPTI -
แหม่ม ผมกับ glutamax ขนาดกลาง ( SF ) ; Invitrogen ) logarithmically เติบโต
SP2 / 0-ag14 การพัฒนาเซลล์มีการล้างใน SF ปานกลางและเพิ่มการเติบโตทางเศรษฐกิจ
5 : 1 อัตราส่วนของผลผลิตการเติบโตทางเศรษฐกิจเพื่อการพัฒนาเซลล์ เซลล์จำนวน 10 เม็ด และนำมันออก 1 มิลลิลิตรของ 37 เปอร์เซ็นต์ ( v / v )
สารละลายของพอลิเอทิลีนไกลคอล 4000 ( Merck ) จากนั้นเพิ่ม dropwise เกินระยะเวลา 60 วินาที
หลังจากที่เซลล์ถูกบ่มอีก 60 วินาทีที่ 37 องศา8 ml SF
ปานกลาง ตามด้วย 5 OPTI มล แหม่มกับ glutamax / 10% ( v / v ) ซีรัมลูกโค ( fetal FCS
; bodinco ) , แล้วค่อยๆเพิ่มกับอ่อนโยน เขย่า หลังจาก 30 นาทีที่ 15 ครับ เซลล์มีเม็ด ล้างใน OPTI แหม่ม ผมกับ glutamax / 10% FCS

ลบตกค้างพอลิเอทิลีนไกลคอล และสุดท้ายชุบความเข้มข้น 105
เซลล์ / 200 ปี่ต่อได้ดีใน OPTI แหม่ม ผมกับ glutamax / 10% FCS / 50x hybri maxtm
เร่งรีบ ( เดอโนโวสังเคราะห์ดีเอ็นเอยับยั้ง ; Sigma ) จากวันที่ 7 , เร่งรีบ
เลือกอาหารเติมทุก 2-3 วัน และในวันที่ 14 มันถูกแทนที่ด้วย 20 OPTI แหม่ม ผมกับ glutamax / 10% FCS . ชม. ซึ่งผลิตแอนติบอดี
( เมาส์ IgG คลาส ) กับฮิวเมน cd134 ( ร่ม + ธรรมดาและลักษณะการไหลที่ใช้รีคอมบิแนนต์
เทคนิคฮิวเมน cd134 : ฮิวเมนเฟย์ฟิวชั่น
โปรตีน ( R & D ระบบ เห็นตัวอย่างที่ 11 ( ด้านล่าง ) และฮิวเมน cd134 การแสดง
ผา ( โรช ) - กระตุ้น CD4 ทีเซลล์ระเบิด ( เห็นตัวอย่างที่ 2 ( เป็น ) ด้านล่าง ) เป็นเป้าหมายที่ 25 ตามลำดับ ) ขยายตรวจสอบคุณภาพ และของโดยการเจือจาง
แอนติ - ฮิวเมน cd134 เฉพาะโมโนโคลนอลแอนติบอดีเป็นโปรตีนบริสุทธิ์ใช้ G
คอลัมน์ ( GE Healthcare ) และส่งผลให้แอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
12h3 แอนติบอดีโคลนและโคลน 20e5


30 ตัวอย่าง 2 ลักษณะการไหลของแอนติฮิวเมน cd134
- เมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและ 12h3 20e5


( A ) cd134 การแสดงออกบนผา กระตุ้นฮิวเมน T
ฮิวเมนลิมโฟไซต์เม็ดเลือดขาวปกติจากผู้บริจาคเซลล์ ( 2 ) สุขภาพ ( ความยินยอม ) แยกตามความหนาแน่นปั่นบน lymphoprep ( 1.077 g / ml ; ) ) ต่อมา 1-2x106 2 / ml ในอาหารเลี้ยงเชื้อ rpmi-1640
( gibco ) ที่มี 10% เซรั่มของลูกวัว ( bodinco ) และ 50 RG / ml เจนตาไมซิน ( gibco ) 5 ~ 0 , 0.1 , 1.0 ค็อค 10.0 หมู / ml phytohemagglutinin-m ( pha-m ;
โรช ) คาร์บอนไดออกไซด์ 5% 37 °องศาเซลเซียส / 1-3 วัน หลังจากที่วัฒนธรรม ขาว เก็บใส่ 1-2x106
ที่เซลล์ต่อมิลลิลิตรในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มีน้ำแข็งแช่เย็นเกลือ 0.1% bovine serum albumin
( Sigma ) / 005 % nan3 ( PBS / เอ / nan3 ) เสริมด้วย 10 %
ฮิวเมนพู เซรั่ม ( HPS ; บล็อก FCY รีเซปเตอร์ ; biowhittaker ) เซลล์มี
10 แยก 10 lighnl อาดเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน act35 ( เมาส์ไอโซไทป์ BD BIOSCIENCES ( ; , ให้ alphen แรยน์
เดอ , เนเธอร์แลนด์ ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากล้าง
อย่างละเอียดพีบีเอส / เอ / nan3 เซลล์ จัดการแยก 1:200 เจือจาง PE -
conjugated แพะแอนติ - เมาส์ IgG ( แจ็คสัน immunoresearch ) 30
15 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่ม
กับฟลูออเรสซีนไอโซไทโอไซยาเนต ( fitc เจือจาง 1 : 20 ) และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
ทันทีตรวจหาแอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) T ลิมโฟไซต์สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C .
หลังจากอย่างละเอียดล้าง PBS / เอ / nan3 เซลล์ที่ได้รับการแก้ไขในฟอร์ม 2 %
PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา ผูกพันและการวัดการไหล ( 20 ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES )

ตามที่แสดงในรูป 1 ( n = 1 จากผู้บริจาคเลือดที่ได้มาแต่ละ ) , อุปกรณ์ต่อพ่วง -
กระตุ้น / พักผ่อนฮิวเมน T ลิมโฟไซต์ไม่แสดงใด ๆ cd134 อย่างไรก็ตาม ปริมาณการ dependently
ผาฮิวเมน cd3p ° sitive T
ลิมโฟไซต์ด่วน 25 ผิว cd134 . เมื่อตาก 10 GG / ml ผา , cd134 ระดับการแสดงออก
เปิดฮิวเมน cd3p ° sitive T ลิมโฟไซต์ประจักษ์ถึงที่ราบสูงระหว่างวัน '
1 ' และ ' 2 ' วัน อย่างไรก็ตามร้อยละของฮิวเมน cd134positive / cd3positive
ลิมโฟไซต์เวลา dependently เพิ่มขึ้นในระหว่างการทดลอง


30 ( B ) cd134 การแสดงออกบนผา กระตุ้นฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์

subpopulation ผากระตุ้น ( 0 และ 10 ลีกเป็นเวลา 1 วัน ดูข้างบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ใน 1-2x106
เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 เสริม 10% HPS ( บล็อก FCY รีเซปเตอร์ ; biowhittaker ) เซลล์ที่ถูกบ่มกับเจือจาง 10 fitc conjugated เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 ( BD BIOSCIENCES ( 1 : 10 ) ค็อคเจือจาง fitc conjugated
เมาส์แอนติ - ฮิวเมนการศึกษาแอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) ร่วมกับ 110 5 เจือจางใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ PE และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โคลน
act35 ( BD BIOSCIENCES ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดล้าง
PBS / เอ / nan3 เซลล์ที่ได้รับการแก้ไขในฟอร์ม 2 % ใน PBS / เอ / น่าน 30
นาทีที่ 4 องศา ข้อผูกพันแอนติบอดีเป็นวัดโดยใช้ อัตราการไหล ( facscalibur BD BIOSCIENCES (
;
)
10 ดังแสดงในรูป 2การแสดงออก cd134 ถูกพบบนผา กระตุ้นฮิวเมน cd4positive T
ลิมโฟไซต์และไม่ได้พักผ่อนฮิวเมน cd4positive
ลิมโฟไซต์ . การแสดงออก cd134 ต่ำถูกพบบนผาถ่านฮิวเมน cd8p0sitive T ลิมโฟไซต์และไม่ได้พักผ่อนฮิวเมน cd8positive T ลิมโฟไซต์ ( ข้อมูลไม่
15 แสดง )

( C )ผูกพันของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3
20e5 บนผาและกระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ผากระตุ้น ( 10 p.g/ml เป็นเวลา 2 วัน ดูข้างบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง t 20 ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ในเซลล์ / มล. ใน 1-2x106
น้ำแข็งเย็น PBS / เอ / nan3 เสริม 10% HPS ( บล็อก FCY รีเซปเตอร์ ;
biowhittaker ) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0 , - , 0.02 , 0.07 , 0.2 , 0.6 , 1.9 , 5.6 , ญี่ปุ่น :
, P , g / ml ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน
act35 ( เมาส์ไอโซไทป์ BD BIOSCIENCES ( ; ) และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134
25 12h3 ค็อคแอนติบอดีโคลนโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซัก
ใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ จัดการแยก 1:200 เจือจาง PE -
conjugated แพะแอนติ - เมาส์ IgG ( แจ็คสัน immunoresearch ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C
หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / / nan3 BSA , เซลล์ที่ถูกบ่ม
1 :20 ดอลลาร์ fitc conjugated เมาส์แอนติ - ฮิวเมนทันทีแอนติบอดี ( BD
30 วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) เพื่อตรวจหา T ลิมโฟไซต์เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากล้างอย่างละเอียด
PBS / เอ / nan3 เซลล์ที่ถูกกำหนดใน 2% ฟอร์มาลดีไฮด์ใน PBS / เอ / น่าน
เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา และได้ผูกพัน การไหล ( facscalibur BD BIOSCIENCES (

; ) ดังแสดงในรูป 3 ( หมายถึง 1 SD ;ผลที่พบในผู้บริจาค ) , เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน act35 12h3 โคลนและโคลนคืออิ่มตัวโมเลกุลบนผิวฮิวเมน cd134 ผากระตุ้น cd3p0sitive T
ลิมโฟไซต์ที่ประมาณ 5.0-10.0 GG / ml โดยใช้เหล่านี้ 2 ผู้บริจาคครึ่งสูงสุดผูกพัน 5 สังเกตที่ = 0.5 pg / ml สำหรับเมาส์ฮิวเมน cd134 โคลนแอนติบอดีต่อต้าน 12h3 และ
C -- = 25 i.g/ml สำหรับแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 act35 แอนติบอดีโคลนและโคลน 20e5 .
( D ) ผูกพันของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 20e5 บนผาและกระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง CD4 บวกและ CD8 T

10 บวกลิมโฟไซต์ผากระตุ้น ( 20 i.tg/ml 1 วัน ดูข้างบน ) ฮิวเมน cd134
การแสดง T ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ใน 1-2x106
เซลล์ / มล. ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 เสริม 10% HPS ( บล็อก FCY
รีเซปเตอร์ ; biowhittaker ) เซลล์มีการแยก 20.014/ml เมาส์ igglx
15 ไอโซไทป์ควบคุม ( BD BIOSCIENCES ) , ค็อคกับ 20.0 i.tg/ml เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนโคลน 20e5 12h3 ค็อคเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจาก
อย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ จัดการแยก 100
PE เจือจาง - แอนติบอดี IgG conjugated แพะแอนติเมาส์ ( แจ็คสัน immunoresearch )
4 ° C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ ถูก
20 บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C 120 ดอลลาร์ fitc conjugated เมาส์แอนติ -
ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) ค็อคกับ 1 fitc เจือจางและเมาส์
แอนติ - ฮิวเมนการศึกษาแอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) เพื่อตรวจหา T ลิมโฟไซต์แต่ละ .
หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ที่ได้รับการแก้ไขในฟอร์ม 2 %
PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาผูกพันและการวัดการไหล 25 ( facscalibur BD BIOSCIENCES (
; )