In this study, most of the EIV-spec

In this study, most of the EIV-specific candidate primers through primer4clades bound either directly to or near a conserved region with a few mismatches or several degenerate codes in each segment. Thus, more concrete steps were required to validate primer specificity. For this, BLAST and fuzznuc, functionally complementary tools to evaluate specificity in primer binding sites, were employed. These approaches worked well in most cases, and they were especially useful for filtering out problematic primers with degenerate codes by evaluating matches between primer sequences and target sequences and estimating the cross-reactivity possibility with other hosts. However, since BLAST treats degenerate codes (e.g., Y, R, A, K, M, etc.) as ‘mismatches’, sequences with many degenerate codes could be removed at an initial validation step. In that case, it was difficult to estimate the exact primer coverage and evaluation scores. For instance, primer sequences with degenerate codes, 1(PB1), 5(PA), 9(NP), and 12(NA) did not meet the requirement of satisfying values in the total score, query cover, and E-value in Table 1. To overcome the limitation, fuzznuc was used as an alternative and complementary method because it considers degenerate codes and mismatches using regular expression syntax. Through the two processes, we selected final 16 primer pairs, which specifically bind to equine influenza virus with less degeneracy.

Frequent point mutations of influenza virus increase the degeneracy of primers. To measure the variation at each nucleotide position, Analyze Sequence Variation (SNP) analysis was conducted using each primer. No primer pairs with highly variable sites (i.e., nearly 200 score) or completely conserved sites with 0 score were observed in the primer lists (Appendix Fig. 2; Fig. 2). Four sites with relatively high variation scores (≥40) existed in number four (NP forward primer). In particular, PA reverse primer (7) had the majority of variable sites with eight. However, applied DPO system for the primer increased its specificity to amplify the PCR region; thus, co-amplifications with other hosts were not observed in this study. In light of the result, it showed that long primer sequences with many degenerate codes could be effectively controlled by DPO system to increase primer specificity.

The efficiency of PCR amplification for EIV-specific primers was assessed using PCR products generated from 46 influenza A viruses, which are composed of representatives from each lineage. In the singleplex RT-PCR assays for each primer pair, some cross reactivity with other hosts was observed. However, as a strategy to block nonspecific binding, the DPO system was effectively utilized in this study. Especially, the criterion for modification into the DPO system was that the conserved sites must be located in the 3′end of primers. That is because DPO system was sensitive to the changes of the 3′ end.

Using the characteristics of DPO, some of the candidate primers were manually adjusted. After DPO application, we observed the primer specificity to target host sequences was dramatically increased. Accordingly, the high specificity of DPO primers and several conventional primers described in Table 1 could be experimentally validated by producing apparently unique amplifications from distinct lineages (Fig. 3).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการศึกษานี้ส่วนใหญ่ของไพรเมอร์ผู้สมัคร EIV เฉพาะผ่าน primer4clades ผูกพันทั้งทางตรงหรือใกล้เขตป่าสงวนที่มีไม่กี่ที่ไม่ตรงกันหรือรหัสเลวหลายแห่งในแต่ละกลุ่ม ดังนั้นขั้นตอนที่เป็นรูปธรรมมากขึ้นก็จะต้องตรวจสอบความจำเพาะไพรเมอร์ สำหรับเรื่องนี้ระเบิดและ fuzznuc, หน้าที่เสริมเครื่องมือในการประเมินความจำเพาะในเว็บไซต์ที่มีผลผูกพันไพรเมอร์ที่ถูกว่าจ้าง วิธีการเหล่านี้ทำงานได้ดีในกรณีส่วนใหญ่และพวกเขาก็มีประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการกรองจากไพรเมอร์ที่มีปัญหาด้วยรหัสที่เลวโดยการประเมินการแข่งขันระหว่างลำดับไพรเมอร์และลำดับเป้าหมายและการประเมินความเป็นไปได้ปฏิกิริยาข้ามกับครอบครัวอื่น ๆ อย่างไรก็ตามตั้งแต่ BLAST ถือว่าเลวรหัส (เช่น, Y, R, A, K, M, ฯลฯ ) เป็น 'ไม่ตรงกัน' ลำดับด้วยรหัสที่เลวจำนวนมากจะถูกลบออกในขั้นตอนการตรวจสอบเบื้องต้น ในกรณีที่ว่ามันเป็นเรื่องยากที่จะประเมินความคุ้มครองที่แน่นอนไพรเมอร์และการประเมินผลคะแนน ยกตัวอย่างเช่นลำดับไพรเมอร์ที่มีรหัสเลว 1 (Pb1), 5 (PA), 9 (NP) และ 12 (NA) ไม่ได้ตอบสนองความต้องการของค่าความพึงพอใจในคะแนนรวมปกแบบสอบถามและ e-ค่าใน ตารางที่ 1 การเอาชนะข้อ จำกัด ที่ fuzznuc ถูกนำมาใช้เป็นทางเลือกและวิธีการที่สมบูรณ์เพราะจะมีการพิจารณารหัสเลวและไม่ตรงกันโดยใช้ไวยากรณ์แสดงออกปกติ ผ่านกระบวนการที่สองเราเลือกสุดท้ายคู่ไพรเมอร์ 16 ซึ่งเฉพาะผูกกับเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ม้าที่มีความเสื่อมน้อย. กลายพันธุ์จุดบ่อยของเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่เพิ่มความเสื่อมของไพรเมอร์ ในการวัดการเปลี่ยนแปลงในแต่ละตำแหน่งเบสวิเคราะห์ลำดับการเปลี่ยนแปลง (SNP) การวิเคราะห์ได้ดำเนินการใช้แต่ละไพรเมอร์ ไม่มีคู่ไพรเมอร์กับเว็บไซต์ตัวแปร (เช่นเกือบ 200 คะแนน) หรือสมบูรณ์เว็บไซต์อนุรักษ์กับ 0 คะแนนถูกตั้งข้อสังเกตในรายการไพรเมอร์ (ภาคผนวกรูปที่ 2. รูปที่ 2). สี่เว็บไซต์ที่มีคะแนนการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างสูง (≥40) อยู่ในบ้านเลขที่สี่ (NP ไปข้างหน้าไพรเมอร์) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PA ไพรเมอร์กลับ (7) มีส่วนใหญ่ของเว็บไซต์ตัวแปรแปด แต่ใช้ระบบ อ.ส.ค. สำหรับไพรเมอร์ที่เพิ่มขึ้นความจำเพาะของเพื่อขยายภูมิภาค PCR; จึงร่วมขยายเสียงกับครอบครัวอื่น ๆ ไม่ได้ถูกตั้งข้อสังเกตในการศึกษาครั้งนี้ ในแง่ของผลที่ได้ก็แสดงให้เห็นว่าลำดับไพรเมอร์ยาวกับรหัสเลวจำนวนมากสามารถควบคุมได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยระบบ อ.ส.ค. เพื่อเพิ่มความจำเพาะไพรเมอร์. ประสิทธิภาพของการขยาย PCR สำหรับไพรเมอร์ EIV เฉพาะที่ได้รับการประเมินโดยใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ที่เกิดจากไวรัส 46 ไข้หวัดใหญ่ ซึ่งจะประกอบด้วยผู้แทนจากแต่ละเชื้อสาย ในการตรวจ singleplex RT-PCR สำหรับแต่ละคู่ไพรเมอร์บางคนเกิดปฏิกิริยาข้ามกับครอบครัวอื่น ๆ พบว่า แต่เป็นกลยุทธ์เพื่อป้องกันการเชิญชมผูกพันระบบ อ.ส.ค. ถูกใช้อย่างมีประสิทธิภาพในการศึกษานี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเกณฑ์สำหรับการปรับเปลี่ยนเข้าสู่ระบบ อ.ส.ค. คือการที่เว็บไซต์อนุรักษ์จะต้องตั้งอยู่ใน 3'end ของไพรเมอร์ นั่นเป็นเพราะระบบ อ.ส.ค. คือไวต่อการเปลี่ยนแปลงของ 3 'สิ้นสุด. ใช้ลักษณะของ อ.ส.ค. บางส่วนของไพรเมอร์ผู้สมัครที่ได้รับการปรับตนเอง หลังจากการประยุกต์ใช้ อ.ส.ค. เราสังเกตจำเพาะไพรเมอร์ที่จะกำหนดเป้าหมายลำดับเจ้าภาพเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว ดังนั้นความจำเพาะสูงของไพรเมอร์ อ.ส.ค. และไพรเมอร์ทั่วไปหลายอธิบายไว้ในตารางที่ 1 จะได้รับการตรวจสอบโดยการทดลองการผลิตเครื่องขยายเสียงที่ไม่ซ้ำกันเห็นได้ชัดจาก lineages ที่แตกต่างกัน (รูปที่. 3)