2.6. Epifluorescence and phase-cont

2.6. Epifluorescence and phase-contrast microscopy
The effect of various pressures on the membrane potential and
membrane integrity of L. monocytogenes LGB was investigated on
samples specifically prepared for microscopy observations. Pasteurized
smoothies were aseptically centrifuged at 12,000  g to remove
insoluble matter, inoculated as described above and treated at the
conditions of the D and E treatments (Table 1). Cells were recovered
from the samples before and after treatments by gentle centrifugation
(400g,10 min),washed (0.1% peptonewater) and the resulting
pellet was used for staining by two fluorescent dye preparations.
The two component LIVE/DEAD BacLight kit (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands) was used to observe the membrane
integrity. Staining was performed on a cell pellet from a 1 mL
sample according to the manufacturer suggestions, and 5 mL of the
stained suspension was spotted onto a slide for microscopy. Untreated
and thermally inactivated L. monocytogenes cultures were
used as positive and negative controls, respectively.
The lipophilic cationic carbocyanine dye JC-1 (Molecular Probes)
exhibits a potential-dependent membrane permeation. The critical
dye concentration is achieved in the cytoplasm when membranes
are polarized, allowing the yellow/red fluorescing J aggregates to
form. In cells with depleted membrane potentials only monomers
of the dye are observed in the cytoplasm (green fluorescence)
(Cossarizza, Baccarani-Contri, Kalashnikova, & Franceschi, 1993).
Therefore, according to the potential depletion intensity, fluorescence
ranges from red to green.
JC-1 was dissolved in DMSO to a stock concentration of 10 mg/
mL (w/v) and stored in the dark until use. After JC-1 dilution (1:100
in PBS), 0.5 mL were used to suspend the cell pellet derived from
0.5 mL of sample. Then, the sample was incubated in the dark at
37 C for 15 min, washed twice and the dyed cells were suspended
in 0.3 mL of PBS before microscopy observations (5 mL).
Due to the short half-life of the stain, the digital images were
rapidly acquired using an epifluorescence microscope BX52
(Olympus Italia, Segrate, I) coupled to a ColorView II camera (SIS,
Munster, DE) and equipped with a double-band pass fluorescence
optical filter set for the simultaneous imaging of fluorescein
(485 ± 15 nm ex, 505 ± 15 nm em) and Texas red dyes (585 ± 15 nm
ex, 625 ± 15 nm em). The apparatus was also equipped with a
phase-contrast optic.
Images of each sample were acquired from 20 fields each containing
200e300 cells in order to approximately estimate the
number of cells in different physiological states.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การ Epifluorescence และความคมชัดระยะ microscopyผลของแรงกดดันต่าง ๆ ในเมมเบรนมีศักยภาพ และความสมบูรณ์ของเยื่อของ L. monocytogenes LGB ถูกสอบสวนในตัวอย่างที่เตรียมไว้โดยเฉพาะสำหรับการสังเกต microscopy Pasteurizedน้ำปั่นได้ centrifuged ที่ g 12000 เอา asepticallyขึ้นเรื่อง inoculated ที่อธิบายข้างต้น และถือว่าในการเงื่อนไขของการรักษาที่ D และ E (ตาราง 1) เซลล์ที่ถูกกู้คืนจากตัวอย่างก่อน และ หลังการบำบัดโดย centrifugation อ่อนโยน(400 กรัม 10 นาที), หิน (0.1% peptonewater) และการส่งผลเม็ดใช้สำหรับย้อมสีโดยเตรียมย้อมฟลูออเรสสองชุด LIVE/ตาย BacLight คอมโพเนนต์สองที่ (Probes โมเลกุลไลเดน ประเทศเนเธอร์แลนด์) ถูกใช้เพื่อสังเกตการเมมเบรนความสมบูรณ์ของการ ย้อมสีทำตามเม็ดเซลล์จาก 1 mLตัวอย่าง ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ 5 mL ของแขวนทิ้งคราบด่างถูกลงบนภาพนิ่งสำหรับ microscopy ไม่ถูกรักษาและยกเลิกแพ L. monocytogenes วัฒนธรรมใช้เป็นตัวควบคุมบวก และลบ ตามลำดับสีย้อม lipophilic cationic carbocyanine เจซี-1 (Probes โมเลกุล)การจัดแสดงการซึมผ่านเมมเบรนขึ้นอยู่กับศักยภาพ ที่สำคัญความเข้มข้นของสีย้อมทำในไซโทพลาซึมเมื่อเยื่อหุ้มมีโพลาไรซ์ สีเหลือง/แดง fluorescing J เพิ่มเพื่อช่วยให้แบบฟอร์มการ ในเซลล์ที่มีเมมเบรนพิกศักยภาพ monomers เท่านั้นของสีที่พบในไซโทพลาซึม (fluorescence สีเขียว)(Cossarizza, Baccarani Contri, Kalashnikova และ Franceschi, 1993)ดังนั้น ตามศักยภาพการลดลงของความเข้ม fluorescenceช่วงสีแดงกับสีเขียวเจซี-1 ถูกละลายใน DMSO เพื่อความเข้มข้น 10 มก.หุ้น /มล (w/v) และเก็บไว้ในมืดจนใช้ หลังจากเจือจางเจซี-1 (1: 100ใน PBS), ใช้ 0.5 mL ไประงับเม็ดเซลล์มา0.5 มล.ของตัวอย่าง แล้ว ตัวอย่างที่ incubated ในมืดที่37 C 15 นาที ล้างสองและเซลล์ที่ย้อมถูกหยุดชั่วคราวใน 0.3 mL ของ PBS ก่อนสังเกต microscopy (5 มล.)เนื่องจากมี half-life สั้นของคราบ ภาพดิจิตอลได้อย่างรวดเร็วมาใช้กล้องจุลทรรศน์การ epifluorescence BX52(เลียโอลิมปัส Segrate ฉัน) ควบคู่กับกล้อง ColorView II (SISเสาะ DE) พร้อม fluorescence ผ่านสองวงตัวกรองแสงที่ตั้งค่าสำหรับภาพพร้อมของ fluorescein(485 nm ± 15 ex, em 505 ± 15 nm) และสีแดงเท็กซัส (585 ± 15 nmอดีต 625 ± 15 nm ยาว) เครื่องที่พักการระยะความคมชัดแสงรูปภาพของแต่ละอย่างได้รับมาจาก 20 เขตข้อมูลแต่ละที่ประกอบด้วยเซลล์ 200e300 เพื่อประเมินประมาณการจำนวนเซลล์ในอเมริกาสรีรวิทยาแตกต่างกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 Epifluorescence
และเฟสตรงกันข้ามกล้องจุลทรรศน์ผลของแรงกดดันต่างๆในเมมเบรนที่มีศักยภาพและความสมบูรณ์ของเมมเบรนของ
L. monocytogenes LGB
ถูกตรวจสอบในตัวอย่างที่เตรียมไว้โดยเฉพาะสำหรับการสังเกตกล้องจุลทรรศน์ พาสเจอร์ไรส์สมูทตี้ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ปลอดเชื้อ?
g
เพื่อลบเรื่องที่ไม่ละลายน้ำฉีดวัคซีนตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและรับการรักษาที่เงื่อนไขของ
D และการรักษาอี (ตารางที่ 1)
เซลล์ที่ถูกกู้คืนจากตัวอย่างก่อนและหลังการรักษาโดยการหมุนเหวี่ยงอ่อนโยน
(400? กรัม 10 นาที) ล้าง (0.1% peptonewater)
และส่งผลให้เม็ดที่ใช้สำหรับการย้อมสีสองเตรียมสีย้อมเรืองแสง.
ทั้งสองสดองค์ประกอบ / ชุด BacLight ตาย (พร็อบโมเลกุล
Leiden, เนเธอร์แลนด์)
ถูกใช้ในการสังเกตเมมเบรนสมบูรณ์ การย้อมสีที่ได้ดำเนินการในตะกอนเซลล์จากมิลลิลิตร 1
ตัวอย่างตามข้อเสนอแนะของผู้ผลิตและ 5
มิลลิลิตรของช่วงล่างเป็นด่างสีลงบนสไลด์สำหรับกล้องจุลทรรศน์ ได้รับการรักษาและการใช้งานความร้อน L. monocytogenes วัฒนธรรมที่ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบตามลำดับ. ประจุบวก lipophilic carbocyanine ย้อม JC-1 (วัดระดับโมเลกุล) การจัดแสดงนิทรรศการการซึมผ่านเมมเบรนที่มีศักยภาพขึ้นอยู่กับ สำคัญความเข้มข้นของสีย้อมจะประสบความสำเร็จในพลาสซึมเมื่อเยื่อมีโพลาไรซ์ที่ช่วยให้สีเหลือง/ สีแดงเรืองแสง J มวลเพื่อรูปแบบ ในเซลล์ที่มีศักยภาพเยื่อหมดโมโนเมอร์เพียงของสีย้อมที่มีการตั้งข้อสังเกตในพลาสซึม (เรืองแสงสีเขียว) (Cossarizza, Baccarani-Contri, Kalashnikova และ Franceschi, 1993). ดังนั้นตามความเข้มของการสูญเสียที่อาจเกิดขึ้นเรืองแสงช่วงจากสีแดงเป็นสีเขียว. JC-1 ถูกละลายใน DMSO ที่จะมีความเข้มข้นของหุ้น 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร (w / v) และเก็บไว้ในที่มืดจนการใช้งาน หลังจาก JC-1 เจือจาง (1: 100 ในพีบีเอส), 0.5 มิลลิลิตรถูกนำมาใช้ในการระงับตะกอนเซลล์ที่ได้มาจาก0.5 มิลลิลิตรของกลุ่มตัวอย่าง จากนั้นกลุ่มตัวอย่างถูกบ่มในที่มืดที่37 องศาเซลเซียสนาน 15 นาทีล้างสองครั้งและเซลล์ย้อมถูกระงับใน0.3 มิลลิลิตรพีบีเอสก่อนที่จะสังเกตกล้องจุลทรรศน์ (5 มล.) เนื่องจากมีครึ่งชีวิตสั้น ๆ ของคราบที่ ภาพดิจิตอลที่ได้มาอย่างรวดเร็วโดยใช้กล้องจุลทรรศน์epifluorescence BX52 (โอลิมปัอิตาลี Segrate ผม) ควบคู่กับกล้อง Colorview ii (SIS, มอนสเตอร์, DE) และติดตั้งผ่านสองครั้งที่วงเรืองแสงกรองแสงตั้งค่าสำหรับการถ่ายภาพพร้อมกันของfluorescein ( 485 ± 15 นาโนเมตรอดีต 505 ± 15 นาโนเมตร em) และเท็กซัสสีแดง (585 ± 15 นาโนเมตรอดีต625 ± 15 นาโนเมตร em) อุปกรณ์ก็ยังมาพร้อมกับแก้วนำแสงเฟสตรงกันข้าม. รูปภาพของแต่ละตัวอย่างที่ได้มาจาก 20 สาขาแต่ละที่มี200e300 เซลล์ในการสั่งซื้อประมาณประเมินจำนวนของเซลล์ในรัฐทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 epifluorescence และต่างระดับจุลทรรศน์
ผลของแรงกดดันต่าง ๆ บนแผ่นเมมเบรนที่มีศักยภาพและความสมบูรณ์ของ monocytogenes lgb
L
ถูกตรวจสอบในตัวอย่างโดยเฉพาะเตรียมไว้สำหรับใช้สังเกตการณ์ พาสเจอร์ไรส์
ปั่นเป็น aseptically ระดับที่ 12 , 000  กรัมลบ
เรื่องไม่ละลายหัวเชื้อที่อธิบายข้างต้นและได้รับการรักษาที่
เงื่อนไขของ D และ E แตกต่างกัน ( ตารางที่ 1 ) เซลล์ที่พบ
จากตัวอย่างก่อนและหลังการรักษาโดย
ปั่นอ่อนโยน ( 400  กรัม , 10 นาที ) , ล้าง ( 0.1% peptonewater ) และผล
เม็ดใช้คุณสมบัติสองการเตรียมสีย้อมเรืองแสง .
2 ส่วนประกอบสด / ตาย baclight Kit ( โมเลกุล )
, ไลเดน ประเทศเนเธอร์แลนด์ ) ถูกใช้เพื่อสังเกตเยื่อ
ความซื่อสัตย์วิธีการคือใช้เม็ดเซลล์จากตัวอย่าง 1 ml
ตามที่ผู้ผลิตแนะนำ และ 5 มิลลิลิตร
เปื้อนช่วงล่างเป็นด่างบนสไลด์สำหรับกล้องจุลทรรศน์ . รักษาและยับยั้ง monocytogenes วัฒนธรรมซึ่ง
L
ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบตามลำดับ บวก carbocyanine
ลิโพฟิลิก ( โมเลกุล ) )
jc-1 ย้อมจัดแสดงเมมเบรนขึ้นอยู่กับศักยภาพ ความเข้มข้นสีย้อมผ้าวิกฤต
ได้ในไซโตปลาสซึมเมื่อ membranes
เป็นขั้วให้เหลือง / แดง fluorescing J มวลรวม

แบบฟอร์ม ในเซลล์ที่มีเยื่อมศักยภาพเพียงเมอร์
ของสีย้อมจะสังเกตได้ในไซโตปลาสซึม ( เรืองแสงสีเขียว )
( cossarizza baccarani contri kalashnikova , , , &ฟรันจี ีส , 1993 ) .
ดังนั้นตามความเข้มของศักยภาพเรืองแสง
ช่วงจากสีแดงเป็นสีเขียว .
jc-1 ละลายใน DMSO เพื่อความเข้มข้น 10 มก. / มล. หุ้น
( w / v ) และจัดเก็บไว้ในที่มืดจนกว่าจะใช้ หลังจาก jc-1 เจือจาง ( 1 : 100
ใน PBS ) , 0.5 ml ใช้ระงับเซลล์เม็ดมาจาก
0.5 ml ของกลุ่มตัวอย่าง แล้วตัวอย่างที่บ่มในที่มืดที่
37  C เป็นเวลา 15 นาทีล้างสองครั้งและย้อมเซลล์ถูกระงับใน 0.3 มิลลิลิตรก่อน
PBS กล้องจุลทรรศน์สังเกต ( 5 ml ) .
เนื่องจากครึ่งชีวิตสั้นของคราบ , ภาพดิจิตอลเป็นอย่างรวดเร็วเป็น epifluorescence
โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ bx52
( Olympus เลีย เซกราเต ผมคู่กับกล้อง colorview II ( พี่
สเตอร์ de ) พร้อมคู่วงผ่านการ
ชุดกรองแสงสำหรับการถ่ายภาพพร้อมกันี่
( 485 ± 15 nm แฟนเก่า , 505 ± 15 nm เอ็ม ) และสีแดง ( 585 ±เท็กซัส 15 nm
แฟนเก่า , 625 ± 15 nm เอ็ม ) อุปกรณ์ก็พร้อม

ต่างระดับมองเห็น ภาพของแต่ละตัวอย่างได้มาจาก 20 เขต แต่ละที่มี
200e300 เซลล์เพื่อประมาณค่า
จำนวนเซลล์ในรัฐทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน