For each sample, we amplified the V

For each sample, we amplified the V4 region 16S rRNA genes
using a broadly conserved primer set (515F/806R, 50-GTGCCAGC
MGCCGCGGTAA-30/50-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-30). The PCR
primers were constructed as follow: forward primer = 454
Titanium Lib-l Primer A/5-base barcode/forward 16S primer and
reverse primer = 454 Titanium Lib-l Primer B/reverse 16S primer
(Peiffer et al., 2013). PCR reactions were carried out in triplicate
20-lL reactions with 0.4 lM forward and reverse primers, 1-lL
template DNA, 250 nM dNTP and a 1 FastPfu buffer. All dilutions
were carried out using certified DNA-free PCR water. Thermal
cycling consisted of initial denaturation at 95 C for 2 min followed
by 25 cycles of denaturation at 95 C for 30 s, annealing at 55 C for
30 s, an extension at 72 C for 30 s, with a final extension of 5 min
at 72 C. Replicate amplicons were pooled and visualized on 2.0%
agarose gels using a SYBR Safe DNA gel stain in 1 TAE.
After purification using a spin column (QIAGEN, Düsseldorf,
Germany), DNA fragments with ligated adapter molecules on both

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับตัวอย่างแต่ละ เราขยายยีน V4 ภูมิภาค 16S rRNAใช้รองพื้นทั่วไปนำชุด (515F/806R, 50-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-30/50-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-30) การ PCRไพรเมอร์ถูกสร้างดังต่อไปนี้: ส่งต่อรองพื้น = 454รองพื้นไปบาร์โค้ด 16S Lib l พื้น A/5-ฐานไทเทเนียม และกลับพื้น = 454 พื้นไทเทเนียม Lib l พื้น B/กลับ 16S(Peiffer et al., 2013) ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการ triplicate20 จะปฏิกิริยากับ 0.4 lM ไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ 1 จะดีเอ็นเอต้นแบบ 250 nM dNTP และบัฟเฟอร์ FastPfu 1 ทั้งหมด dilutionsได้ดำเนินการใช้น้ำฟรี DNA PCR ได้รับการรับรอง ความร้อนจักรยานประกอบด้วย denaturation เริ่มที่ 95 C ใน 2 นาทีด้วยโดยรอบ 25 ของ denaturation ที่ 95 C สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 55 C สำหรับ30 s ส่วนขยายที่ 72 C สำหรับ 30 s ขยายสุดท้าย 5 นาทีค. 72 Replicate amplicons ถูกทางถูกพู และ visualized บน 2.0%ใช้ดีเอ็นเอปลอดภัย SYBR เจ agarose เจคราบในเต้ 1หลังจากฟอกโดยใช้คอลัมน์หมุน (QIAGEN ดึสเซลดอร์ฟเยอรมนี), ชิ้นส่วนดีเอ็นเอกับโมเลกุลการ์ดควบทั้งสองอย่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับแต่ละตัวอย่างเราขยายภูมิภาค V4 ยีน 16S rRNA
โดยใช้ชุดอนุรักษ์ไพรเมอร์ในวงกว้าง (515F / 806R 50 GTGCCAGC
MGCCGCGGTAA-30/50 GGACTACHVGGGTWTCTAAT-30) PCR
ไพรเมอร์ที่ถูกสร้างขึ้นดังต่อไปนี้ไปข้างหน้าไพรเมอร์ = 454
ไทเทเนียมรองพื้น Lib ลิตร A / 5 ฐานบาร์โค้ด / ไปข้างหน้า 16S
ไพรเมอร์และไพรเมอร์กลับ= 454 ไทเทเนียม Lib ลิตรรองพื้น B / กลับ 16S ไพรเมอร์
(. Peiffer et al, 2013) . ปฏิกิริยา PCR
ได้ดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่าในปฏิกิริยาที่20 จะมี 0.4 LM ไปข้างหน้าและไพรเมอร์ย้อนกลับ 1 LL
ดีเอ็นเอแม่แบบ 250 นาโนเมตรและ dNTP 1 บัฟเฟอร์ FastPfu เจือจางทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้น้ำที่ผ่านการรับรอง PCR ดีเอ็นเอฟรี
ความร้อนขี่จักรยานประกอบด้วย denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามมา 25 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา30 วินาทีซึ่งเป็นส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, ที่มีนามสกุลสุดท้าย 5 นาทีที่72 องศาเซลเซียส ทำซ้ำ amplicons ถูกรวบรวมและมองเห็นบน 2.0% เจล agarose ใช้ SYBR คราบเจลดีเอ็นเอตู้นิรภัยที่ 1? TAE. หลังจากการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์หมุน (QIAGEN, Düsseldorf, เยอรมนี) ดีเอ็นเอกับโมเลกุลอะแดปเตอร์ ligated ทั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับแต่ละตัวอย่าง เราขยายเขต / เบส 16S rRNA ยีน
ใช้วงกว้างเพื่อรองพื้นชุด ( 515f / 806r 50-gtgccagc
, mgccgcggtaa-30 / 50-ggactachvgggtwtctaat-30 ) pcr
โดยสร้างตาม : ส่งต่อรองพื้น = 454
ไทเทเนียม lib-l รองพื้น / 5-base บาร์โค้ด / ไปข้างหน้าและย้อนกลับใช้ไพรเมอร์รองพื้น
= 454 ไทเทเนียม lib-l รองพื้นใช้รองพื้นแบบ B /
( ไพเฟอร์ et al . , 2013 )ปฏิกิริยา PCR พบว่าทั้งสามใบ
20 จะมีปฏิกิริยากับ 0.4 LM ไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ 1-ll
แม่แบบดีเอ็นเอ , 250 nm dntp และ 1  fastpfu บัฟเฟอร์ วิธีการทดลองใช้ทั้งหมด
รับรองตรวจดีเอ็นเอฟรีน้ำ ความร้อน
จักรยานเป็นครั้งแรก ( ที่ 95  C 2 นาทีตาม
25 รอบ ( 95  เป็นเวลา 30 วินาที annealing ที่ 55  C
30 วินาทีส่วนขยายที่ 72  เป็นเวลา 30 วินาที ด้วยส่วนขยายสุดท้าย 5 นาทีที่ 72  C
เลียนแบบ amplicons ถูก pooled และภาพปรากฏการณ์ที่ 2.0 %
( เจลใช้ SYBR ปลอดภัยดีเอ็นเอเจลคราบใน 1  แท .
หลังจากฟอกใช้ปั่นคอลัมน์ ( QIAGEN ดึสเซลดอร์ฟเยอรมนี , ,
) ดีเอ็นเอกับผูกอะแดปเตอร์โมเลกุลทั้งสอง