Microorganism
The strain used throughout this work was Acetobacter aceti NRRL B-999. This strain was
kindly provided in lyophilized form from ARS culture collection (Peoria, IL, USA). The
lyophilized cells were activated first in Yeast Peptone mannitol medium (YPM) and
cultivated in incubator shaker for 24 h at 28°C. The obtained cells were subcultured on YPM
medium supplemented with agar 20 g/L. The grown colonies were harvested in 50 %
glycerol and subsequently stored in cryovials for cell banking at -80 °C to minimize the
productivity loss by subsequent cultivations of cells. Each experiment was started by revival
of one glycerol vial in vegetative culture.
Inoculum preparation
Inoculum was prepared in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml YPM medium
composed of (g/L): yeast extract, 5, peptone, 3 and mannitol, 25. After sterilization for 15
min at 121°C, 50 ml YPM medium was inoculated with 250 μl of glycerol culture. The
inoculated flasks were incubated on the rotary shaker (Innova 4080, New Brunswick
Scientific Co., NJ, USA) at 200 rpm and 28°C for 24 h. Cells were used thereafter to
inoculate either 250 ml Erlenmeyer flasks or stirred tank bioreactor with inoculum
concentration of 10% (v/v).
Screening media for acetic acid production
Six different media were used in this study for primary evaluation for primary selection of
the highly productive medium. All these media were reported before for their ability to
support cell growth and acetic acid production by A. aceti. The composition of these media
were as follows in (g/L): Medium (1): Glucose, 10; K2HPO4, 0.1; KH2PO4, 0.9; (NH4)2SO4,
1.5; MgSO4.7H2O, 0.2; NaCl, 0.01; FeSO4.7H2O, 0.01; MnSO4.H2O, 0.01; Yeast extract, 10;
0.1M Citric acid, 50 ml, pH 5.0 14; Medium (2): Yeast extract, 5; Peptone, 2; Glycerol, 30,
pH 6.3 15; Medium (3): Yeast extract, 5; Peptone, 2; Glucose, 30. pH 6.3 15; Medium (4):
Ethanol, 47.4; Glucose, 1; Peptone, 2; Yeast extract, 5; Acetic acid, 10. pH 6.3 16; Medium
(5): Glucose, 2; Yeast extract, 3; Polypeptone, 2.; Glycerol, 3, pH 6.5 9; Medium (6):
Glucose, 100; Yeast extract, 3; Polypeptone, 2; Glycerol, 3 at pH 6.5 9. The carbon source of
each medium was sterilized separately and added to the fermentation medium before
inoculation. The inoculated flasks were incubated on the rotary shaker (Innova 4080, New
Brunswick Scientific Co., NJ, USA) at 200 rpm and 28°C.
Medium Optimization
For acetic acid medium optimization experiments, the strain was cultivated on medium No.
3 which composed of (g/L): glucose, 30; polypeptone, 2; yeast extract, 5 with different
glucose concentrations up to 120 g/L and incubated on rotary shaker under the same
conditions above mentioned. Subsequently, cultivations were conducted at different yeast
extract concentrations (0-15 g/L), followed by further investigation on the effect of peptone
concentration (0-6 g/L) on cell growth and acetic acid production.
Bioreactor cultivations
Cultivation in stirred tank bioreactor were conducted using the optimized medium in shake
flask level and run under the same cultivation conditions in term of inoculums size,
MicroorganismThe strain used throughout this work was Acetobacter aceti NRRL B-999. This strain waskindly provided in lyophilized form from ARS culture collection (Peoria, IL, USA). Thelyophilized cells were activated first in Yeast Peptone mannitol medium (YPM) andcultivated in incubator shaker for 24 h at 28°C. The obtained cells were subcultured on YPMmedium supplemented with agar 20 g/L. The grown colonies were harvested in 50 %glycerol and subsequently stored in cryovials for cell banking at -80 °C to minimize theproductivity loss by subsequent cultivations of cells. Each experiment was started by revivalof one glycerol vial in vegetative culture.Inoculum preparationInoculum was prepared in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml YPM mediumcomposed of (g/L): yeast extract, 5, peptone, 3 and mannitol, 25. After sterilization for 15min at 121°C, 50 ml YPM medium was inoculated with 250 μl of glycerol culture. Theinoculated flasks were incubated on the rotary shaker (Innova 4080, New BrunswickScientific Co., NJ, USA) at 200 rpm and 28°C for 24 h. Cells were used thereafter toinoculate either 250 ml Erlenmeyer flasks or stirred tank bioreactor with inoculumconcentration of 10% (v/v).Screening media for acetic acid productionSix different media were used in this study for primary evaluation for primary selection ofthe highly productive medium. All these media were reported before for their ability tosupport cell growth and acetic acid production by A. aceti. The composition of these mediawere as follows in (g/L): Medium (1): Glucose, 10; K2HPO4, 0.1; KH2PO4, 0.9; (NH4)2SO4,1.5; MgSO4.7H2O, 0.2; NaCl, 0.01; FeSO4.7H2O, 0.01; MnSO4.H2O, 0.01; Yeast extract, 10;0.1M Citric acid, 50 ml, pH 5.0 14; Medium (2): Yeast extract, 5; Peptone, 2; Glycerol, 30,pH 6.3 15; Medium (3): Yeast extract, 5; Peptone, 2; Glucose, 30. pH 6.3 15; Medium (4):Ethanol, 47.4; Glucose, 1; Peptone, 2; Yeast extract, 5; Acetic acid, 10. pH 6.3 16; Medium(5): Glucose, 2; Yeast extract, 3; Polypeptone, 2.; Glycerol, 3, pH 6.5 9; Medium (6):Glucose, 100; Yeast extract, 3; Polypeptone, 2; Glycerol, 3 at pH 6.5 9. The carbon source ofeach medium was sterilized separately and added to the fermentation medium beforeinoculation. The inoculated flasks were incubated on the rotary shaker (Innova 4080, NewBrunswick Scientific Co., NJ, USA) at 200 rpm and 28°C.Medium OptimizationFor acetic acid medium optimization experiments, the strain was cultivated on medium No.3 which composed of (g/L): glucose, 30; polypeptone, 2; yeast extract, 5 with differentglucose concentrations up to 120 g/L and incubated on rotary shaker under the sameconditions above mentioned. Subsequently, cultivations were conducted at different yeastextract concentrations (0-15 g/L), followed by further investigation on the effect of peptoneconcentration (0-6 g/L) on cell growth and acetic acid production.Bioreactor cultivationsCultivation in stirred tank bioreactor were conducted using the optimized medium in shakeflask level and run under the same cultivation conditions in term of inoculums size,
การแปล กรุณารอสักครู่..
จุลินทรีย์
สายพันธุ์ที่ใช้ตลอดการทำงานนี้เป็นเชื้อสายพันธุ์มาตรฐาน NRRL B-999 สายพันธุ์นี้ได้รับการ
ให้ความกรุณาในรูปแบบแห้งจากการเก็บรวบรวมวัฒนธรรม ARS (พีโอเรีย, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา)
เซลล์แห้งถูกเปิดใช้งานครั้งแรกในกลางยีสต์เปปโตนแมนนิทอล (YPM) และ
ปลูกในศูนย์บ่มเพาะปั่นเป็นเวลา 24 ชั่วโมงวันที่ 28 ° C เซลล์ที่ได้มาเลี้ยงใน YPM
กลางเสริมด้วยวุ้น 20 กรัม / ลิตร ที่ปลูกเป็นอาณานิคมเก็บเกี่ยวใน 50%
กลีเซอรอลและต่อมาเก็บไว้ในธนาคาร cryovials สำหรับมือถือที่ -80 องศาเซลเซียสเพื่อลด
การสูญเสียผลผลิตโดยการเพาะปลูกที่ตามมาของเซลล์ แต่ละการทดลองเริ่มต้นจากการฟื้นตัว
ของขวดกลีเซอรอลเป็นหนึ่งในวัฒนธรรมพืช.
เชื้อเตรียม
กล้าเชื้อถูกจัดทำขึ้นในขวด 250 มล Erlenmeyer มี 50 มลกลาง YPM
ประกอบด้วย (g / L): สารสกัดจากยีสต์, 5, เปปโตน, 3 และแมนนิทอล 25 . หลังจากการฆ่าเชื้อเป็นเวลา 15
นาทีที่ 121 ° C, 50 มลกลาง YPM ได้รับเชื้อด้วย 250 ไมโครลิตรของวัฒนธรรมกลีเซอรอล
ขวดเชื้อบ่มในเครื่องปั่นแบบหมุน (Innova 4080, New Brunswick
Scientific Co. , นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา) ที่ 200 รอบต่อนาทีและ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกนำมาใช้นั้นไม่นานในการ
ฉีดวัคซีนทั้ง 250 มล. ขวด Erlenmeyer หรือถังหมักแบบกวนกับหัวเชื้อ
เข้มข้น 10% (v / v).
สื่อการคัดกรองสำหรับการผลิตกรดอะซิติก
หกสื่อที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้สำหรับการประเมินผลหลักสำหรับการเลือกหลักของ
สูง ขนาดกลางที่มีประสิทธิผล สื่อทั้งหมดเหล่านี้ได้รับรายงานมาก่อนสำหรับความสามารถในการ
สนับสนุนการเจริญเติบโตของเซลล์และการผลิตกรดอะซิติกโดย A. Aceti องค์ประกอบของสื่อเหล่านี้
มีดังนี้ใน (g / L): ขนาดกลาง (1): กลูโคส 10; K2HPO4 0.1; KH2PO4 0.9; (NH4) 2SO4,
1.5; MgSO4.7H2O 0.2; โซเดียมคลอไรด์, 0.01; FeSO4.7H2O 0.01; MnSO4.H2O 0.01; สารสกัดจากยีสต์, 10;
0.1M กรดซิตริก 50 มลค่า pH 5.0 ที่ 14; ขนาดกลาง (2): สารสกัดจากยีสต์ 5; เปปโตน, 2; กลีเซอรีน, 30,
พีเอช 6.3 15; ปานกลาง (3): สารสกัดจากยีสต์ 5; เปปโตน, 2; กลูโคส 30. ค่า pH 6.3 15; ขนาดกลาง (4):
เอทานอล 47.4; กลูโคส 1; เปปโตน, 2; สารสกัดจากยีสต์, 5; กรดอะซิติก 10. ค่า pH 6.3 16; ขนาดกลาง
(5): กลูโคส 2; สารสกัดจากยีสต์, 3; Polypeptone 2 .; กลีเซอรีน, 3, พีเอช 6.5 9; ปานกลาง (6):
กลูโคส 100; สารสกัดจากยีสต์, 3; Polypeptone, 2; กลีเซอรีน 3 ที่ pH 6.5 9. แหล่งคาร์บอนของ
แต่ละสื่อได้รับการฆ่าเชื้อที่แยกจากกันและเพิ่มไปยังกลางหมักก่อนที่จะ
ฉีดวัคซีน ขวดเชื้อบ่มในเครื่องปั่นแบบหมุน (Innova 4080, นิว
บรันสวิกวิทยาศาสตร์ Co. , นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา) ที่ 200 รอบต่อนาทีและ 28 ° C.
การเพิ่มประสิทธิภาพปานกลาง
สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองอะซิติกกรด, สายพันธุ์ได้รับการปลูกฝังในสื่อฉบับที่
3 ซึ่ง ประกอบด้วย (g / L): น้ำตาลกลูโคส 30; polypeptone, 2; สารสกัดจากยีสต์, 5 ที่แตกต่างกัน
มีความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคสได้ถึง 120 กรัม / ลิตรและบ่มในเครื่องปั่นโรตารี่ภายใต้เดียวกัน
เงื่อนไขดังกล่าวข้างต้น ต่อมาได้ดำเนินการเพาะปลูกที่แตกต่างกันยีสต์
ความเข้มข้นของสารสกัด (0-15 กรัม / ลิตร) ตามด้วยการสอบสวนเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลของเปปโตน
เข้มข้น (0-6 กรัม / ลิตร) ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และการผลิตกรดอะซิติก.
เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเพาะปลูก
การเพาะปลูกในกวน ถังปฏิกรณ์ชีวภาพถูกดำเนินการโดยใช้สื่อที่ดีที่สุดในการสั่นไหว
ระดับขวดและทำงานภายใต้สภาพการเพาะปลูกเดียวกันในแง่ของขนาดหัวเชื้อแบคทีเรีย,
การแปล กรุณารอสักครู่..
จุลินทรีย์ในอาหารสายพันธุ์ที่ใช้ตลอดงานนี้คือ Acetobacter aceti NRRL b-999 . สายพันธุ์นี้คือกรุณาระบุไว้ในรูปแบบแห้งจากคอลเลกชันวัฒนธรรม ARS ( พีโอเรีย , IL , USA ) ที่ไลโอเซลล์ถูกใช้งานครั้งแรกในยีสต์ extract mannitol ขนาดกลาง ( YPM ) และเลี้ยงในตู้ Shaker สำหรับ 24 ชั่วโมง ที่ 28 องศา ได้ถูก subcultured YPM ในเซลล์อาหารสูตร MS ที่เสริมด้วยวุ้น 20 กรัม / ลิตร โต 50% เก็บในอาณานิคมกลีเซอรอลและถูกเก็บไว้ใน cryovials ( เซลล์ที่ - 80 ° C เพื่อลดผลผลิตสูญเสียโดยต่อมาเพาะเซลล์ แต่ละการทดลองเริ่มจากการฟื้นฟูหนึ่งในวัฒนธรรมของกลีเซอรอลี่ผักการเตรียมเชื้อเชื้อที่เตรียมไว้ในขวดบรรจุ 50 ml 250 มิลลิลิตร เออร์เลนเมเยอร์ YPM ขนาดกลางประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร ) : สารสกัดจากยีสต์ , 5 , ตามลำดับ , 3 และ 5 , 25 . หลังจากฆ่าเชื้อสำหรับ 15Min ที่ 121 ° C , 50 ml YPM กลางเป็นเชื้อกับ 250 μ L วัฒนธรรมของกลีเซอรอล . ที่เป็นเชื้อบ่มในขวดเขย่า โรตารี่ ( Innova 4080 บรุนซ์ใหม่วิทยาศาสตร์ Co . , NJ , USA ) ที่ความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีและ 28 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นเซลล์ก็ใช้ปลูกฝีด้วย 250 ml เออร์เลนเมเยอร์ขวดหรือถังหมักแบบกวนด้วยเชื้อความเข้มข้น 10 เปอร์เซ็นต์ ( v / v )การตรวจคัดกรองสื่อเพื่อการผลิตกรด6 สื่อต่าง ๆที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ เพื่อประเมินหลักสำหรับการเลือกของระดับปานกลาง มีประสิทธิภาพสูง สื่อเหล่านี้มีรายงานก่อน เพื่อความสามารถในการสนับสนุนการเจริญและการผลิตกรดโดย ใช้ . องค์ประกอบของสื่อเหล่านี้มีดังนี้ ( กรัม / ลิตร ) ขนาดกลาง ( 1 ) : กลูโคส , 10 ; k2hpo4 0.1 ; kh2po4 0.9 ; 2so4 ( NH4 ) ,1.5 ; mgso4.7h2o 0.2 ; NaCl 0.01 ; feso4.7h2o 0.01 ; mnso4.h2o 0.01 ; สารสกัดจากยีสต์ , 10 ;0.1m กรดซิตริก , 50 ml . , pH 5.0 14 ; ปานกลาง ( 2 ) : สารสกัดจากยีสต์ , 5 ; extract , 2 ; กลีเซอรอล 30pH 6.3 15 ; ปานกลาง ( 3 ) : สารสกัดจากยีสต์ , 5 ; extract , 2 ; กลูโคส , 30 pH 6.3 15 ; ปานกลาง ( 4 ) :เอทานอล , 47.4 ตามลำดับ กลูโคส 1 ; 2 ; 3 ; สารสกัดจากยีสต์ , กรดน้ำส้ม , 10 pH 6.3 16 ; ปานกลาง( 5 ) : กลูโคส , 2 ; สารสกัดจากยีสต์ , 3 ; polypeptone 2 ; กลีเซอรอล , 3 , pH 6.5 9 ; ปานกลาง ( 6 )สารสกัดจากยีสต์กลูโคส 100 ; 3 ; polypeptone 2 ; กลีเซอรอล 3 ที่ pH 6.5 9 แหล่งคาร์บอนของแต่ละสื่อก็ฆ่าเชื้อแยกและเพิ่มระยะเวลากลางก่อนการฉีดวัคซีน การปลูกและบ่มในขวดเขย่า โรตารี่ ( Innova 0 ใหม่บรุนซ์ทางวิทยาศาสตร์ Co . , NJ , USA ) ที่ความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีและ 28 องศาการเพิ่มประสิทธิภาพปานกลางกรดปานกลางเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการทดลอง สายพันธุ์ปลูกในไม่กลาง3 ซึ่งประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร ) : กลูโคส , 30 ; polypeptone 2 ; สารสกัดจากยีสต์ , 5 แตกต่างกันกลูโคสที่ความเข้มข้นไม่เกิน 120 กรัม / ลิตร และบ่มในเครื่องปั่นหมุนภายใต้เดียวกันเงื่อนไขดังกล่าว ภายหลังเพาะมีวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน ยีสต์สารสกัดเข้มข้น ( 0-15 กรัม / ลิตร ) รองลงมา คือ การสอบสวนเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลของเปปโตนสมาธิ ( 0-6 กรัม / ลิตร ) ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และการผลิตกรด .เครื่องเพาะเลี้ยงในถังหมักแบบกวนการใช้อาหารที่เหมาะสมในการเขย่าระดับขวดและเรียกใช้ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน การปลูกระยะเวลา 18 ชั่วโมง ขนาด ,
การแปล กรุณารอสักครู่..