using a DNAzol reagent (Invitrogen

using a DNAzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA)
according to the manufacturer’s protocol.
PCR identification and partial sequences of tuf gene
Internal fragment of the tuf gene was amplified using primers
set designed from ATCC43078 (AF276263);
tuf1: 50-GTAGTTGCTTCAACAGACGG-30 and tuf2: 50-
GGCGATTGGGTGGATCAACTC-30 that yield 795-bp.
Generally, the PCR mixture was subjected on a thermal cycler
to the following program; a denaturation at 95 C for
4 min followed by 35 cycles of denaturation at 95 C for
30 s, annealing at 51 C for 30 s, extension at 72 C for
90 s, and a final extension at 72 C for 10 min. The amplified
fragment of tuf gene of thirteen S. dysgalactiae isolates was
then sequenced according to the method reported by
Abdelsalam et al. [8]. Briefly, the amplified products of thirteen
isolates were directly ligated into the plasmid pGEM-T
Easy vector (Promega, Madison, WI, USA), and the recombinant
plasmid was introduced into Escherichia coli DH5a
according to the manufacture’s protocol. Plasmid DNA was
purified by using the QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen,
Germantown, MD, USA). Sequencing reactions were performed
by using the GenomeLab DTCS Quick Start Kit
(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) with the oligonucleotide
primers SP6 (5-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3)
and T7 (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3). The PCR
products were loaded into the CEQ 8000 Genetic Analysis
System (Beckman Coulter), and the nucleotide sequence
was determined. The nucleotide sequences were analyzed by
using BioEdit version 7.0 [25]. The phylogenetic analysis
was then carried out by the neighbor joining method using
MEGA version 5 [26].
Biased sinusoidal field gel electrophoresis (BSFGE)
The restriction enzyme-digested chromosomal DNA was analyzed
by BSFGE [8,18]. S. dysgalactiae isolates were cultured
on THA at 37 C for 24 h, and the preparation of genomic
DNA and DNA digestion with a restriction SmaI enzyme was
carried out according to the previously described method [8].
Briefly, plugs prepared from the isolates were treated sequentially
with 1 mL of lysis buffer, pH 8.0 (0.1M EDTA with
0.05% lauroylsarcosine) containing 5 mg mL1 lysozyme. After
incubation at 37 C for 3 h with gentle shaking, the plugs were
replaced in 1 mL of proteinase solution (30 units mL1 proteinase
K in 0.1M EDTA with 1% sodium dodecyl sulfate), and
incubated at 55 C over night with gentle shaking. The incubated
plugs were washed 6 times in 2.5 mL TE buffer and stored
in TE buffer at 4 C until the DNA digestion was performed
using restriction enzyme. Macrorestriction fragment digested
with SmaI was separated using 1% agarose horizontal gel by
the BSFGE system (Genofield; ATTO, Tokyo, Japan). After
gel electrophoresis, the gel was stained and visualized under
UV light. The macrorestriction patterns were visually analyzed.
BSFGE pattern analysis
The trial version of phoretix 1D software (TotalLab Ltd, Newcastle
upon Tyne, United Kingdom) was used to analyzed

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ใช้รีเอเจนต์ DNAzol (Invitrogen คาร์ลส สหรัฐอเมริกา)ตามโพรโทคอลของผู้ผลิตรหัส PCR และลำดับบางส่วนของยีน tufส่วนภายในของยีน tuf ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ชุดที่ออกแบบมาจาก ATCC43078 (AF276263);tuf1: 50-GTAGTTGCTTCAACAGACGG-30 และ tuf2: 50 -GGCGATTGGGTGGATCAACTC-30 ที่ก่อ 795-bpทั่วไป ส่วนผสม PCR ถูกยัดเยียดใน cycler ร้อนโปรแกรมต่อไปนี้ denaturation ที่ 95 C สำหรับ4 นาทีตามรอบ 35 ของ denaturation ที่ C 95 ใน30 s การอบเหนียวที่ C 51 สำหรับ 30 s, 72 C สำหรับ90 s และส่วนขยายเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 C สำหรับ 10 นาที ที่เอาต์ส่วน tuf ยีนของสิบสามลักษณะ S. dysgalactiae แยกเป็นแล้ว เรียงลำดับตามวิธีการรายงานAbdelsalam et al. [8] สั้น ๆ ผลิตภัณฑ์เอาต์ของ thirteenแยกได้โดยตรงควบเป็น plasmid pGEM-Tเวกเตอร์กลาย (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา), และวททชplasmid ถูกนำเข้าสู่ Escherichia coli DH5aตามโพรโทคอลการผลิต Plasmid DNA ได้บริสุทธิ์ โดยใช้ QIAprep หมุน Miniprep ชุด (QiagenGermantown, MD สหรัฐอเมริกา) ลำดับปฏิกิริยาดำเนินโดย GenomeLab DTCS ด่วนเริ่มต้นชุด(Beckman Coulter ฟู CA, USA) กับ oligonucleotideไพรเมอร์ SP6 (5-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3)และ T7 (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3) PCRผลิตภัณฑ์ถูกโหลดลงในวิเคราะห์พันธุกรรม 8000 CEQระบบ (Beckman Coulter), และลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกกำหนด ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกวิเคราะห์โดยใช้ BioEdit เวอร์ชัน 7.0 [25] วิเคราะห์ phylogeneticถูกแล้วดำเนินการ โดยเพื่อนบ้านที่เข้าร่วมโดยใช้วิธีร็อครุ่น 5 [26]ลำเอียงฟิลด์ sinusoidal electrophoresis เจล (BSFGE)มีวิเคราะห์การย่อยเอนไซม์จำกัดของโครโมโซม DNAโดย BSFGE [8,18] S. dysgalactiae แยกมีอ่างในท่าที่ 37 C 24 ชม และเตรียมของ genomicดีเอ็นเอและดีเอ็นเอสงวน SmaI ถูกเอนไซม์ย่อยอาหารในดำเนินตามวิธีอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [8]สั้น ๆ ปลั๊กที่เตรียมจากแยกได้รับการรักษาตามลำดับมี 1 mL lysis บัฟเฟอร์ ค่า pH 8.0 (EDTA 0.1M ด้วย0.05% lauroylsarcosine) ที่ประกอบด้วย 5 mg mL 1 lysozyme หลังจากบ่มที่ 37 C สำหรับ h 3 กับสั่นอ่อนโยน ปลั๊กถูกแทนที่ใน 1 mL ของโซลูชัน proteinase (30 หน่วย mL 1 proteinaseK ใน 0.1 M EDTA ด้วย 1% โซเดียมซัลเฟต dodecyl), และincubated ที่ 55 C ข้ามคืนด้วยการสั่นเบา ๆ ที่ incubatedปลั๊กล้าง 6 ครั้งในบัฟเฟอร์ TE 2.5 mL และเก็บในบัฟเฟอร์ TE ที่ 4 C จนกระทั่งดีเอ็นเอที่ ทำย่อยอาหารใช้เอนไซม์จำกัด ส่วน Macrorestriction ต้องโดย SmaI ถูกแยกโดยใช้ 1% agarose แนวเจโดยระบบ BSFGE (Genofield ATTO โตเกียว ญี่ปุ่น) หลังจากเจ electrophoresis เจสี และ visualized ภายใต้แสง UV เห็นได้วิเคราะห์รูปแบบ macrorestrictionวิเคราะห์รูปแบบ BSFGEรุ่นทดลองของซอฟต์แวร์ 1D phoretix (TotalLab Ltd นิวคาสเซิลใช้วิเคราะห์ตามไทน์ สหราชอาณาจักร)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โดยใช้ DNAzol? รีเอเจนต์ (Invitrogen, คาร์ลส, ประเทศสหรัฐอเมริกา)
. ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต
บัตรประจำตัว PCR และลำดับบางส่วนของ TUF ยีน
ส่วนภายในของยีน TUF ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์
ชุดที่ออกแบบมาจาก ATCC43078 (AF276263);
tuf1: 50-GTAGTTGCTTCAACAGACGG-30 และ tuf2: 50-
GGCGATTGGGTGGATCAACTC-30 ให้ผลผลิต 795-bp.
โดยทั่วไปส่วนผสม PCR ยู่บน Cycler ความร้อน
ไปยังโปรแกรมดังต่อไปนี้ denaturation ที่ 95? C เป็นเวลา
4 นาทีตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95? C เป็นเวลา
30 วินาที, การอบที่ 51 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, นามสกุลที่ 72? C เป็นเวลา
90 วินาที, และนามสกุลสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสสำหรับ 10 นาที ขยาย
ส่วนของยีน TUF สิบสามเอไอโซเลท dysgalactiae ถูก
ติดใจแล้วตามวิธีการรายงานโดย
Abdelsalam และคณะ [8] สั้น ๆ , ผลิตภัณฑ์ขยายสิบสาม
สายพันธุ์ที่ถูก ligated โดยตรงในพลาสมิด pGEM-T
ง่ายเวกเตอร์ (Promega, Madison, WI, USA) และ recombinant
พลาสมิดถูกนำเข้าสู่ Escherichia coli DH5a
ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ดีเอ็นเอถูก
ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ QIAprep ปั่น miniprep ชุด (Qiagen,
ทาวน์, MD, USA) ปฏิกิริยาลำดับได้ดำเนินการ
โดยใช้ Genomelab DTCS เริ่มต้นอย่างรวดเร็ว Kit
(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) กับ oligonucleotide
ไพร SP6 (5-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3)
และ T7 (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3) PCR
ผลิตภัณฑ์ถูกโหลดลงใน CEQ 8000 ทางพันธุกรรมการวิเคราะห์
ระบบ (Beckman Coulter) และลำดับนิวคลีโอ
ที่ถูกกำหนด ลำดับเบสที่ได้มาวิเคราะห์โดย
ใช้รุ่น 7.0 BioEdit [25] การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ
จากนั้นก็ดำเนินการโดยเพื่อนบ้านมาร่วมงานกับวิธีการใช้
รุ่น MEGA 5 [26].
ลำเอียงข่าวคราวสนามซายน์ (BSFGE)
ข้อ จำกัด การทำงานของเอนไซม์ย่อยดีเอ็นเอโครโมโซมได้รับการวิเคราะห์
โดย BSFGE [8,18] เอไอโซเลท dysgalactiae มาเพาะเลี้ยง
ในท่าที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและเตรียมความพร้อมของจีโนม
ดีเอ็นเอและการย่อยอาหารของดีเอ็นเอที่มีข้อ จำกัด การทำงานของเอนไซม์เบสได้รับการ
ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [8].
สั้น ๆ , ปลั๊กที่เตรียมจากเชื้อ ได้รับการรักษาตามลำดับ
ด้วย 1 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์สลายพีเอช 8.0 (0.1M EDTA กับ
0.05% lauroylsarcosine) ที่มี 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร 1 lysozyme หลังจาก
บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสนาน 3 ชั่วโมงกับสั่นอ่อนโยนปลั๊กถูก
แทนที่ด้วย 1 มิลลิลิตรของสารละลายโปรตีน (30 หน่วยมิลลิลิตร 1 โปร
K ใน 0.1M EDTA กับโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 1%) และ
บ่มที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสในช่วง คืนเขย่าอ่อนโยน บ่ม
ปลั๊กถูกล้างครั้งที่ 6 ในบัฟเฟอร์ 2.5 มิลลิลิตร TE และเก็บไว้
ในบัฟเฟอร์ TE ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการย่อยอาหารดีเอ็นเอถูกดำเนินการ
โดยใช้เอนไซม์ จำกัด ส่วน Macrorestriction ย่อย
กับเบสถูกแยกออกโดยใช้ 1% agarose เจลในแนวนอนโดย
ระบบ BSFGE (Genofield; ATTO, โตเกียว, ญี่ปุ่น) หลังจาก
electrophoresis เจลเจลถูกสีและมองเห็นภายใต้
แสงยูวี รูปแบบ macrorestriction ถูกนำมาวิเคราะห์สายตา.
BSFGE วิเคราะห์รูปแบบ
รุ่นทดลองของซอฟต์แวร์ phoretix 1D (TotalLab จำกัด , นิวคาสเซิ
upon Tyne, สหราชอาณาจักร) ถูกใช้ในการวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ใช้ dnazol  Reagent ( Invitrogen Carlsbad , USA )
ตามขั้นตอนของผู้ผลิต การลำดับบางส่วนของวิธี PCR และ

เนื่องจากยีนจำเพาะภายในของยีนโดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาจากของ
ชุด atcc43078 ( af276263 ) ;
tuf1 : และ 50-gtagttgcttcaacagacgg-30 tuf2 : 50 -
ggcgattgggtggatcaactc-30 ผลผลิตที่ 795 BP .
โดยทั่วไปร่วมผสมถูกกระทำบน
วงจรความร้อนเพื่อโปรแกรมต่อไปนี้ ; ( 95  C
4 นาทีตามด้วย 35 รอบ ( 95  C
30 วินาที annealing ที่ 51  C 30 S , ส่วนขยายที่ 72  C
90 , และสุดท้ายเป็นส่วนขยายที่ 72  C 10 นาทีทำการ
เบสของยีนของเชื้อ S . dysgalactiae สิบสามประเทศสหรัฐอเมริกาคือ
จากนั้นทำการตามวิธีการที่รายงานโดย
abdelsalam et al . [ 8 ] สั้น ๆ , ขยายผลิตภัณฑ์ของสิบสาม
ไอโซเลทโดยตรงผูกลงในพลาสมิด pgem-t
ง่ายเวกเตอร์ ( promega เมดิสัน , WI , USA ) และรีคอมบิแนนท์พลาสมิด
ถูกใส่เข้าไปในแบคทีเรีย Escherichia coli dh5a
ตามขั้นตอนของการผลิต พลาสมิดดีเอ็นเอ
บริสุทธิ์โดยใช้ qiaprep ปั่น miniprep Kit ( QIAGEN
Germantown , MD , USA )ปฏิกิริยาการจัดลำดับการ
โดยใช้ genomelab DTCs Quick Start Kit
( Beckman Coulter ฟูลเลอร์ตัน แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) ด้วยไพรเมอร์ ซึ่ง sp6 ( 5-atttaggtgacactatagaa-3 )

ที่ 6 กับ 7 ( 5-taatacgactcactataggg-3 ) ผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกโหลดเข้าสู่ CEQ 8000 การวิเคราะห์
พันธุกรรมระบบ ( เบคแมน คูลเตอร์ ) และลำดับนิวคลีโอไทด์
ถูกกำหนดไว้ ลำดับยีนที่วิเคราะห์โดย
การใช้ bioedit รุ่น 7.0 [ 25 ]
วิเคราะห์ ซึ่งได้ดำเนินการโดยเพื่อนบ้านร่วมโดยใช้รุ่นเมกา
5 [ 26 ] .
ลำเอียงไซน์ฟิลด์ gel electrophoresis ( เอนไซม์ย่อย bsfge )

โดยโครโมโซมดีเอ็นเอวิเคราะห์ bsfge [ 8,18 ] เอส dysgalactiae เชื้อเพาะเลี้ยง
ท่าที่ 37  เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และการเตรียมการของจีโนม
ดีเอ็นเอและดีเอ็นเอ การย่อยด้วยเอนไซม์จำกัดสมัย
ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ) [ 8 ] .
สั้น , ปลั๊กที่เตรียมจากเชื้อถูกปฏิบัติราว
1 มิลลิลิตร การสลายบัฟเฟอร์ pH 8.0 ( 0.1m EDTA 0.05% ด้วย
lauroylsarcosine ) ประกอบด้วย 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร  1 ไลโซไซม์ . หลังจาก
บ่มที่ 37  C 3 H กับปลั๊กถูก
อ่อนโยนสั่นแทนที่ใน 1 มิลลิลิตรของสารละลายโปรตีน ( 30 หน่วยต่อ 1 โปร 
K ใน 0.1m EDTA ด้วย 1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ) , และ
 บ่มที่ 55 C ทั้งคืนกับอ่อนโยนสั่น ที่บ่ม
ปลั๊กถูกล้าง 6 ครั้งใน 2.5 ml TE บัฟเฟอร์และเก็บไว้ในบัฟเฟอร์ที่  te
4 C จนถึงการย่อย DNA แสดง
เอนไซม์ จำกัด . macrorestriction ชิ้นส่วนย่อย
กับใช้แยกใช้ 1% หรือแนวนอนโดยเจล
ระบบ bsfge ( genofield ; อัตโต , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) หลังจาก
เจล เจลที่ถูกย้อมสีภาพ
และภายใต้แสงยูวี การ macrorestriction แบบสายตาวิเคราะห์ ผลการวิเคราะห์

bsfge รุ่นทดลองของซอฟต์แวร์ 1D phoretix ( totallab Ltd , นิวคาสเซิลอัพพอนไทน์
, สหราชอาณาจักร ) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์