2.6. Real time PCRThe primers of fo

2.6. Real time PCR
The primers of four myosin heavy chain isoform(MyHCI, IIa, IIx, and
IIb) genes (Wimmers et al., 2008), 18S RNA (Wimmers et al., 2008) and
GPx gene (Gan et al., 2013) were used according to a previous publication.
Primer for LDHwas set using Primer 5.0 software. All primerswere
synthesized commercially by TaKaRa Biotechnology (TakaRa, Dalian,
China) and were showed in Table 2. Quantitative real-time PCR was
performed using SYBR® Premix Ex Taq ll (Tli RNaseH Plus) reagents
(TakaRa, Dalian, China) and a CFX-96 Real-Time PCR detection system
(Bio-Rad, USA). The 18S RNAwas used as the reference gene to normalize
mRNA expressions of target genes. The PCR reaction system
consisted of 12.5 μL SYBR® Premix Ex Taq ll (Tli RNaseH Plus), 1 μL
reverse primers (10 mM), 1 μL forward primers (10 mM), 8.5 μL
doubled-distilled water and 2 μL cDNA in a total volume of 25 μL. Cycling
conditionswere as follows: a prerun at 95 °C for 10 s, 40 cycles of denaturation
step at 95 °C for 5 s, followed by a 60 °C annealing step for 25 s
and a 72 °C extension step for 15 s. After amplification, a melting curve
analysiswas performed to verify the specificity of the reactions.Melting
curve conditionswere: 1 cycle of denaturation at 95 °C for 10 s and then
65 °C changed to 95 °C with a temperature change velocity of 0.5 °C/s.
The standard curve of each gene was run in triplicate for obtaining
reliable amplification efficiency (E). The correlation coefficients of all
standard curves were N0.99 and the E was between 90 and 110%.
Gene expression data were calculated according to a previous publication
(Pfaffl, 2001). The mRNA levels were expressed as the fold change
relative to the mean value of the control group, which was arbitrarily
defined as 1. All experiment sample analysis was repeated in triplicate

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 PCR
เวลาจริงไพรเมอร์ของสี่myosin ไอโซฟอร์มห่วงโซ่หนัก (MyHCI, IIa, IIx และ
IIb) ยีน (Wimmers et al., 2008) 18S อาร์เอ็นเอ (Wimmers et al., 2008)
และยีนGPx (กาน et al., 2013) ถูกนำมาใช้ตามสิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้.
ไพรเมอร์สำหรับ LDHwas ตั้งค่าการใช้รองพื้น 5.0 ซอฟแวร์ ทั้งหมด primerswere
สังเคราะห์ในเชิงพาณิชย์โดย Takara เทคโนโลยีชีวภาพ (Takara
ต้าเหลียนประเทศจีน) และได้รับการแสดงให้เห็นในตารางที่ 2 PCR แบบ real-time
เชิงปริมาณได้ดำเนินการโดยใช้SYBR®พรีมิกซ์Ex Taq LL (Tli RNaseH พลัส) น้ำยา
(Takara ต้าเหลียนประเทศจีน) และ CFX-96 ระบบการตรวจสอบแบบ Real-Time PCR
(Bio-Rad สหรัฐอเมริกา) 18S RNAwas ใช้เป็นยีนอ้างอิงที่จะปรับการแสดงออกของ mRNA ของยีนเป้าหมาย
ระบบปฏิกิริยา PCR
ประกอบด้วย 12.5 ไมโครลิตรSYBR®พรีมิกซ์ Ex Taq LL (Tli RNaseH พลัส) 1
ไมโครลิตรไพรเมอร์กลับ(10 มิลลิเมตร) ไพรเมอร์ไปข้างหน้า 1 ไมโครลิตร (10 มิลลิเมตร) 8.5
ไมโครลิตรสองเท่าน้ำกลั่นและ2 ไมโครลิตรยีนใน ปริมาณรวมของ 25 ไมโครลิตร ขี่จักรยาน
conditionswere ดังนี้ prerun ที่ 95 ° C เป็นเวลา 10 วินาที, 40
รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติขั้นตอนที่95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาทีตามด้วย 60 องศาเซลเซียสขั้นตอนการอบเป็นเวลา 25
วินาทีและ72 องศาเซลเซียสขั้นตอนส่วนขยายสำหรับ 15 วินาที หลังจากที่ขยายโค้งละลาย
analysiswas ดำเนินการในการตรวจสอบความจำเพาะของ reactions.Melting
โค้ง conditionswere: 1 วงจรของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 ° C เป็นเวลา 10 วินาทีแล้ว
65 องศาเซลเซียสการเปลี่ยนแปลงถึง 95 ° C ที่มีความเร็วในการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ 0.5 องศาเซลเซียส / s.
โค้งมาตรฐานของยีนแต่ละคนทำงานในเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับการได้รับประสิทธิภาพที่เชื่อถือได้ขยาย (E)
ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของทุกโค้งมาตรฐานเป็น N0.99 และอีอยู่ระหว่าง 90 และ 110%. ยีนข้อมูลการแสดงนี้จะถูกคำนวณตามสิ่งพิมพ์ก่อนหน้า(Pfaffl, 2001) ระดับ mRNA ถูกแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลงเท่าเทียบกับค่าเฉลี่ยของกลุ่มควบคุมซึ่งได้รับการโดยพลการกำหนดเป็น1. การทดลองวิเคราะห์ตัวอย่างทั้งหมดถูกทำซ้ำในเพิ่มขึ้นสามเท่า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 เวลาจริง PCR ไพรเมอร์ของ myosin
4 ไอโซฟอร์มโซ่หนัก ( myhci จัดขึ้น iix
, , , และด้วย ) ยีน ( wimmers et al . , 2008 ) , 18S RNA ( wimmers et al . , 2008 ) และ
ยีน GPX ( กาน et al . , 2013 ) ถูกใช้ตาม
ประกาศก่อนหน้านี้ รองพื้นสำหรับ ldhwas โดยใช้ไพรเมอร์ 5.0 ซอฟต์แวร์ ทั้งหมด primerswere
สังเคราะห์ในเชิงพาณิชย์โดยเทคโนโลยีชีวภาพ ทาคาระ ( Takara , Dalian ,
จีน ) และถูกแสดงในตารางที่ 2เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
®อดีตได้ดีจะใช้ SYBR ( tli rnaseh พลัส ) สารเคมี
( Takara , Dalian , จีน ) และระบบการตรวจสอบเวลาจริงและ cfx-96
( USA ชีวภาพราด ) ที่พบ rnawas ใช้อ้างอิงปรับการแสดงออกของ mRNA ของยีน
ยีนเป้าหมาย การตรวจปฏิกิริยาระบบ
จำนวน 12.5 μฉัน SYBR ®พรีมิกซ์ แฟนเก่าแทคจะ ( tli rnaseh พลัส ) 1 μ L
กลับไพรเมอร์ ( 10 มม. )1 μฉันไปข้างหน้า ไพรเมอร์ ( 10 มม. ) , 8.5 μ L
สองเท่าน้ำกลั่นและ 2 μ L ยีนในผลรวมปริมาตร 25 ลิตรμจักรยาน
คือดังนี้ : prerun ที่ 95 องศา C 10 , 40 รอบของขั้นตอนที่ 95 องศา C (
5 S , ตามด้วย 60 องศา C อบขั้น 25 S
และ 72 ° C เป็นเวลา 15 วินาที หลังจากขั้นตอนการขยายหลอม
โค้งและทำการตรวจสอบความจำเพาะของปฏิกิริยาหลอม
โค้งคือ 1 รอบของการหยุดชั่วคราวที่ 95 องศา C เป็นเวลา 10 วินาทีและจากนั้น
65 ° C เปลี่ยนเป็น 95 องศา C อุณหภูมิเปลี่ยนแปลงความเร็ว 0.5 ° C / S .
เส้นโค้งมาตรฐานของแต่ละยีนก็เรียกทั้งสามใบเพื่อขอรับ
ประสิทธิภาพเพิ่มจำนวน เชื่อถือได้ ( E ) สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เส้นโค้งมาตรฐาน
เป็น NO .99 และอยู่ระหว่าง 90 และ 110 % E .
ข้อมูลการแสดงออกของยีนได้ตามการประกาศก่อนหน้านี้ (
pfaffl , 2001 ) ระดับ mRNA แสดงออกเหมือนพับเปลี่ยน
เมื่อเทียบกับค่าเฉลี่ยของกลุ่มควบคุม ซึ่งกำลังพล
กำหนดเป็น 1 การทดลองการวิเคราะห์ตัวอย่างกันทั้งสามใบ