Fermentation and samplingThe fermen

Fermentation and sampling
The fermentation experiments were conducted at the Vale do
Juliana cocoa farm in Igrapiúna, Bahia, Brazil. The ripe cocoa pods
from PS1319 hybrid (Porto Seguro, Uruçuca, BA, Brazil) were harvested
in November 2013. The cocoa pods were manually opened
with a machete and the beans were immediately transferred to the
fermentation house. The fermentation started approximately 4 h
after the breaking of the pods and was performed in 0.06 m3
wooden boxes. Each fermentation used 100 kg of cocoa beans.
Fermentations were performed both with and without inoculation
(control) of a mixed yeast starter culture containing S. cerevisiae
UFLA CA11 (LNF- CA11, LNF Latino America, Bento Gonçalves, Rio
Grande do Sul, Brazil), Pichia kluyveri UFLA YCH194 and Hanseniaspora
uvarum UFLA YCH203 at the beginning of the process. The
P. kluyveri and H. uvarum species were separately grown in YPD
broth [10 g/L Yeast extract (Merck); 20 g/L Peptone (Himedia); 20 g/
L dextrose (Merck)] at 30 C and 150 rpm, and replicated every 24 h.
The cells were recovered by centrifugation (7000 rpm, 10 min) and
re-suspended in 1 L of sterile peptone water [1 g/L Peptone
(Himedia)]. This solution was spread over the cocoa beans, reaching
a concentration of approximately 105 cells/g of cocoa. The
S. cerevisiae UFLA CA11 yeast, which is lyophilized by LNF, was
weighed (as recommended by the manufacturer's instructions) and
mixed in the solution with other yeasts to reach a population of
approximately 107 cells/g of cocoa. All fermentations were evaluated
over a period of 168 h, and samples of approximately 100 g
each were withdrawn at 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 h of the
process. The samples were taken approximately 40 cm from the
surface of the center of the fermenting cocoa mass, placed in sterile
plastic pots and transferred to the laboratory. The samples for
chemical and culture-independent analyses were stored at 20 C.
All fermentations were performed in triplicate.
2.2. DNA extraction and qPCR reaction
The total DNA from the cocoa pulp was extracted from samples
with a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) in
accordance with the manufacturer's instructions for DNA purifi-
cation from tissues. The DNA was stored at 20 C for further use.
Specific primers for the S. cerevisiae, P. kluyveri and H. uvarum
yeast species used in this study were previously described by Díaz,
Molina, N€
ahring, and Fischer (2013) and are shown in Table 1. The
specificity of each primer pair was confirmed by searching in
GenBank using BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Real-time PCR was carried out using the Rotor-Gene Q System
(Quiagen, Hombrechtikon, ZH, Switzerland). Each reaction
comprised 12.5 mL 2 Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix
(Qiagen, Stockach, Konstanz, Germany), 0.8 mM of each primer
(Invitrogen, S~
ao Paulo, SP, Brazil) and 1 mL template DNA extracted
from cocoa pulp for a total volume of 25 mL. The mixture was
heated to 95 C for 10 min, followed by 40 cycles of denaturation
at 95 C for 10 s, and annealing/extension at 60 C for 15 s. The
cycling temperature was then increased by 1 C every 5 s from
50 C to 99 C to obtain the melting curve. All analyses were
performed in triplicate. The DNA concentration in the samples was
limited to 50 ng per analysis, except for standard curves prepared
from samples containing a known number of yeast cells. For
standard curves, all yeast species were cultivated in YPD agar at
30 C for 24 h. The cells were counted using a Neubauer chamber.
DNA was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany) and serially diluted (1:10) from 108
e107 down to
10 cell/mL. Each point on the calibration curve was measured in
triplicate.
2.3. Carbohydrates, alcohols and organic acids analysis
The carbohydrates (glucose and fructose), organic acid (acetic,
lactic, and citric acids) and alcohol (ethanol) from cocoa pulp and
beans were extracted and analyzed using a liquid chromatography
system (Shimadzu, model LC-10Ai, Shimadzu Corp., Japan)
equipped with a dual detection system consisting of a UVeVis
detector (SPD 10Ai) and a refractive index detector (RID-10Ai). A
Shimadzu ion exclusion column (Shim-pack SCR-101H,
7.9 mm  30 cm) was operated at 30 C for carbohydrates and
alcohols, and 50 C for acids. Perchloric acid (100 mM) was used as
the eluent at a flow rate of 0.6 mL/min. The acids were detected
via UV absorbance (210 nm), while the alcohols and carbohydrates
were detected via RID. All samples were analyzed in triplicate, and
individual compounds were identified based on the retention time
of standards injected using the same conditions. The sample
concentrations were determined using an external calibration
method. Calibration curves were constructed by injecting different
concentrations of the standards under the same conditions of the
samples analyses and the areas obtained were plotted a linear
curve whose equation was used to estimate the concentration of
the compounds in the sample (Ramos, Dias, Miguel, & Schwan,
2014).
2.4. Sensory analysis of chocolate
After fermentation, the beans were sun dried in drying greenhouses.
Thereafter, the dried beans from the two different
fermentation processes (control and inoculated) were sent for
chocolate production at Sartori and Pedroso Alimentos Ltda. (Sao~
Roque, SP, Brazil). The chocolate contained 70% cocoa.
The sensory analyses of the two kinds of chocolates (from
control and inoculated fermentations) were performed using a
consumer acceptance test followed by a check-all-that-apply
(CATA) question. The tests were conducted on 51 adults over 18
years of age. Participants were 19.3% male and 80.7% female and
were consumers of dark chocolate. For the acceptance test, the
consumers evaluated how much they liked each sample using a 9-
222 N.N. Batista et al. / LWT - Food Science and Technology 63 (2015) 221e227
point hedonic scale (1 ¼ dislike extremely; 2 ¼ dislike very much;
3 ¼ dislike moderately; 4 ¼ dislike slightly; 5 ¼ neither like nor
dislike; 6 ¼ like slightly; 7 ¼ like moderately; 8 ¼ like very much;
9 ¼ like extremely) (Stone & Sidel, 1993). For the CATA question, the
consumers were asked to evaluate seven sensory attributes and
select those they considered appropriate to describe the chocolate.
The attributes were sour, fruity, bitter, astringent, coffee, nutty and
sweet.
The tests were performed in closed cabins with white illumination
at the Sensory Analysis Laboratory, Food Science Department,
Federal University of Lavras (Lavras, MG). The samples were
labeled with three random digits on a white surface. These samples
had a monadic form and followed a balanced order of presentation
(Walkeling & Macfie, 1995). The chocolate was presented in 50 mL
plastic cups containing approximately 2.5 g each. The subjects
rinsed their mouths with water between tastings. The sensory
analysis was performed with the approval of the local ethics
committee (Federal Lavras University, Brazil).
3. Results
3.1. qPCR analysis
Spontaneous and inoculated fermentations of cocoa in a farm
scale were performed in this study. For inoculations, the starter
culture containing S. cerevisiae, P. kluyveri and H. uvarum yeast
species was used. The dynamic behavior of the population of the
starter culture species during cocoa fermentations in the two assays
(control and inoculated) was monitored by qPCR. The sequences
and product sizes of the primers are summarized in
Table 1, as well as the qPCR parameters obtained for standard
curves. Standard curves were established for each primers set. The
reaction efficiencies ranged between 88% (P. kluyveri) and 96%
(S. cerevisiae) with high reproducibility. The lowest detection limit
was 102 cells mL1
. The melt curve analysis for each PCR showed a
single peak (data not shown).
The yeasts S. cerevisiae, P. kluyveri and H. uvarum were detected
and quantified during control and inoculated fermentations by
qPCR (Fig. 1). S. cerevisiae was predominant in both fermentations;
however, in the control the population was lower (ranging from 4.4
to 5.9 log cell/g) than in the inoculated fermentation (ranging from
6.7 to 7.9 log cell/g). In the control, the population of H. uvarum and
P. kluyveri ranged from 3.4 to 4.5 log cell/g and 2.8 to 3.7 log cell/g,
respectively. Whereas in the inoculated assay, P. kluyveri showed
higher population than in the control (3.6e5.0 log cell/g) and
H. uvarum showed similar population (3.6e4.5 log cell/g). It was
expected that higher populations of these species would be found
in the inoculated fermentation than in the control; however this
was not the case for H. uvarum. It seems that the other yeasts,
mainly S. cerevisiae, detected in highest numbers may inhibit the
H. uvarum growth.
3.2. Carbohydrates, ethanol and organic acids during cocoa
fermentation
Carbohydrates, ethanol and organic acids were measured from
the pulp and beans during the cocoa fermentations (Figs. 2 and 3).
Their concentrations at 0 and 168 h are shown in Table 2. For the
pulp, the initial concentrations of glucose, fructose and citric acid
were approximately 25, 30 and 90 g/kg, respectively. The consumption
of these compounds was observed at the initial time of
fermentation (until around 70 h) and carbohydrates were
consumed faster in the inoculated fermentation than in the control
(Fig. 2). At 24 h of fermentation, glucose decreased to values of
13.8 g/kg (control) and 5.4 g/kg (inoculated), and fructose showed
Table 1
Specific primers used for qPCR analysis and qPCR parameters of standard curves obtained from 10-fold dilution of yeast strains DNA by qPCR.
Species Primers qPCR parameters
Name Sequence Product size R2 Slope Efficiency (%)
S. cerervisiae SC-5fw 50
-AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAG-30 215 bp 0.999 3.420 96
SC-3bw 50
-TGAAATGCGAGATTCCCCT-30
P. kluyveri PK-5fw 50
-AGTCTCGGGTTAGACGT-30 169 bp 0.998 3.634 88
PK-3bw 50
-GCTTTTCATCTTTCCTTCACA-30
H. uvarum HU-5fw 50
-GGCGAGGATACCTTTTCTCTG-30 172 bp 0.998 3.515

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หมักและสุ่มตัวอย่างหมักที่ได้ดำเนินการทดลองที่เวลทำฟาร์มจูเลียนาโกโก้ใน Igrapiúna เฮีย บราซิล ฝักโกโก้สุกจาก PS1319 ไฮบริด (Seguro ปอร์โต Uruçuca, BA บราซิล) ถูกเก็บเกี่ยวในปี 2013 เดือนพฤศจิกายน เปิดฝักโกโก้ด้วยตนเองmachete และถั่วถูกโอนย้ายไปทันทีที่บ้านหมัก หมักเริ่มต้นประมาณ 4 hหลังจากการแบ่งของฝัก และมีดำเนินการใน 0.06 m3กล่องไม้ หมักแต่ละใช้โกโก้ 100 กิโลกรัมดำเนินหมักแหนมทั้งมี และไม่ มี inoculation(ตัวควบคุม) ของวัฒนธรรมเริ่มต้นผสมยีสต์ S. cerevisiae ประกอบด้วยUFLA CA11 (LNF - CA11, LNF ลาตินอเมริกา Bento Gonçalves ริโอแกรนด์ไม่เน บราซิล), Pichia kluyveri UFLA YCH194 และ Hanseniasporauvarum UFLA YCH203 ที่จุดเริ่มต้นของกระบวนการ ที่P. kluyveri และ H. uvarum พันธุ์ได้แยกปลูกใน YPDซุป [10 g/L สารสกัดจากยีสต์ (เมอร์ค); 20 g/L Peptone (Himedia) 20 กรัม /ขึ้น L (เมอร์ค)] ที่ 30 C และ 150 rpm และจำลองทุก 24 ชมเซลล์ถูกกู้คืน โดย centrifugation (7000 รอบต่อนาที 10 นาที) และหยุดชั่วคราวอีกครั้งในน้ำ peptone กอซ [1 บัญชี Peptone L 1(Himedia)] โซลูชันนี้ได้แพร่กระจายไปกว่าโกโก้ เข้าถึงความเข้มข้นของเซลล์ประมาณ 105 g ของโกโก้ ที่S. cerevisiae UFLA CA11 ยีสต์ ซึ่งเป็น lyophilized โดย LNF ถูกชั่งน้ำหนัก (แนะนำตามคำแนะนำของผู้ผลิต) และผสมในโซลูชันกับ yeasts อื่น ๆ ถึงประชากรประมาณ 107 เซลล์/กรัมของโกโก้ มีประเมินทั้งหมดหมักแหนมระยะ 168 h และตัวอย่างประมาณ 100 กรัมแต่ละถูกถอนที่ 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 และ 168 h ของการกระบวนการ ตัวอย่างที่ถ่ายประมาณ 40 ซม.จากการผิวของศูนย์กลางมวล fermenting โกโก้ วางในกระบอกพลาสติกกระถาง และโอนย้ายไปยังห้องปฏิบัติการ ตัวอย่างสำหรับวิเคราะห์เคมี และวัฒนธรรมอิสระถูกเก็บไว้ที่ 20 เซลเซียสมีดำเนินการหมักแหนมทั้งหมดใน triplicate2.2. DNA สกัดและ qPCR ปฏิกิริยาDNA ที่รวมจากเนื้อเยื่อโกโก้ถูกสกัดจากตัวอย่างมี QIAamp ดีเอ็นเอขนาดเล็กชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ในสามัคคีคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับ DNA purification จากเนื้อเยื่อ ดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่ C 20 สำหรับใช้เพิ่มเติมไพรเมอร์เฉพาะใน S. cerevisiae, P. kluyveri และ H. uvarumสายพันธุ์ยีสต์ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดย DíazMolina, N€ahring และฟิสเชอร์ (2013) และจะแสดงในตารางที่ 1 ที่specificity ของแต่ละคู่รองพื้นได้รับการยืนยัน โดยการค้นหาในGenBank ที่ใช้ระเบิด (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)PCR แบบเรียลไทม์ถูกดำเนินการโดยใช้ระบบใบพัดยีน Q(Quiagen, Hombrechtikon, ZH สวิตเซอร์แลนด์) แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วย 12.5 mL 2 ใบพัดยีน SYBR Green PCR หลักผสม(Qiagen, Stockach, Konstanz เยอรมนี), 0.8 มม.แต่ละพื้น(Invitrogen, S ~อ่าวเปา SP บราซิล) และแบบ 1 mL สกัดดีเอ็นเอจากเยื่อโกโก้สำหรับไดรฟ์ข้อมูลทั้งหมดของ 25 mL มีส่วนผสมอุณหภูมิ 95 C สำหรับ 10 นาที ตาม ด้วยวงจร 40 การ denaturationที่ 95 C 10 s และการอบเหนียว/ขยายที่ 60 C 15 s ได้แล้วขึ้นขี่อุณหภูมิ โดย 1 C 5 ทุก s จากC 50 C ถึง 99 รับโค้งละลาย วิเคราะห์ทั้งหมดได้ดำเนินการใน triplicate มีความเข้มข้นของดีเอ็นเอในตัวอย่างจำกัด 50 ng ต่อการวิเคราะห์ ยกเว้นเส้นโค้งมาตรฐานที่เตรียมไว้จากตัวอย่างที่ประกอบด้วยชื่อเสียงของเซลล์ยีสต์ สำหรับเส้นโค้งมาตรฐาน สปีชีส์ยีสต์ทั้งหมดถูกปลูกใน agar YPD ที่C 30 ใน 24 ชม เซลล์ถูกนับโดยใช้หอ Neubauerดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้การ QIAamp ดีเอ็นเอขนาดเล็กชุด (Qiagen, Hildenประเทศเยอรมนี) และแตกออก serially (1:10) 108e107 ลงไป10 เซลล์/มล. แต่ละจุดบนเส้นโค้งเทียบถูกวัดในtriplicate2.3 คาร์โบไฮเดรต alcohols และวิเคราะห์กรดอินทรีย์คาร์โบไฮเดรต (น้ำตาลกลูโคสและฟรักโทส), อินทรีย์กรด (อะซิติกกรดแล็กติก และแอซิด ซิทริก) และแอลกอฮอล์ (เอทานอล) จากเยื่อโกโก้ และเมล็ดถูกแยก และวิเคราะห์โดยใช้ chromatography ของเหลวระบบ (Shimadzu รุ่น LC 10Ai, Shimadzu Corp. ญี่ปุ่น)พร้อมกับระบบตรวจจับคู่ประกอบด้วยการ UVeVisเครื่องตรวจจับ (SPD 10Ai) และเครื่องตรวจจับดรรชนี (RID-10Ai) Aคอลัมน์แยกไอออน Shimadzu (Shim ชุด SCR - 101H7.9 มม. 30 ซม.) ถูกดำเนินการที่ 30 C สำหรับคาร์โบไฮเดรต และalcohols และ C 50 สำหรับกรด มีใช้กรด perchloric (100 มิลลิเมตร) เป็นeluent ที่อัตราการไหลของ 0.6 mL/min กรดที่พบผ่าน UV absorbance (210 nm), alcohols และคาร์โบไฮเดรตพบผ่าน RID มีวิเคราะห์ตัวอย่างทั้งหมดใน triplicate และระบุสารประกอบแต่ละตัวตามเวลาเก็บข้อมูลมาตรฐานฉีดใช้เงื่อนไขเดียวกัน ตัวอย่างความเข้มข้นที่กำหนดใช้การปรับเทียบภายนอกวิธีการ เทียบเส้นโค้งถูกสร้าง โดย injecting แตกต่างกันความเข้มข้นของมาตรฐานภายใต้เงื่อนไขเดียวกันของการวิเคราะห์ตัวอย่างและพื้นที่ที่ได้รับถูกพล็อตเป็นเส้นสมการที่ใช้ในการประเมินความเข้มข้นของเส้นโค้งสารในตัวอย่าง (Ramos, Dias, Miguel และ Schwan2014)2.4 การการวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัสของช็อคโกแลตหลังจากหมัก ถั่วถูกแดดในโรงเรือนอบแห้งหลังจากนั้น ถั่วแห้งจากทั้งสองแตกต่างกันกระบวนการหมัก (ควบคุม และ inoculated) ถูกส่งแล้วผลิตช็อกโกแลตที่ Sartori Pedroso Alimentos Ltda. (เซา ~โรเก้ SP บราซิล) ช็อกโกแลตที่ประกอบด้วยโกโก้ 70%วิเคราะห์ทางประสาทสัมผัสของช็อคโกแลต (จากสองชนิดควบคุมและการหมักแหนม inoculated) ได้ดำเนินการโดยใช้การผู้บริโภคยอมรับทดสอบตามเครื่องทั้งหมดว่าใช้คำถาม (CATA) การทดสอบได้ดำเนินการใน 51 ผู้ใหญ่กว่า 18ปีของอายุ ผู้เข้าร่วมได้ 19.3% เพศชายและเพศหญิง 80.7% และผู้บริโภคของช็อกโกแล็ตเข้มได้ สำหรับการทดสอบการยอมรับ การผู้บริโภคประเมินว่าพวกเขาชอบแต่ละอย่างใช้ 9 แบบAl. ร้อยเอ็ดบาทิสตา N.N. 222 / LWT - วิทยาศาสตร์การอาหารและเทคโนโลยี 63 221e227 (2015)ชี้สเกล hedonic (1 ¼ไม่ชอบมาก 2 ¼เกลียดชังมาก3 ¼เกลียดชังปานกลาง 4 ¼ไม่ชอบเล็กน้อย 5 ¼ไม่ชอบหรือ ไม่ไม่ชอบ 6 ¼ชอบเล็กน้อย 7 ¼ชอบปานกลาง 8 ¼เช่นมาก9 ¼ชอบมาก) (หินและ Sidel, 1993) สำหรับคำถามของ CATA การผู้บริโภคก็ต้องประเมินคุณลักษณะทางประสาทสัมผัสที่เจ็ด และเลือกที่จะพิจารณาที่เหมาะสมเพื่ออธิบายการช็อคโกแลตแอตทริบิวต์ถูกเปรี้ยว ผลไม้ ขม astringent กาแฟ หลงใหล และหวานดำเนินการทดสอบในเคบินปิดด้วยรัศมีสีขาวในห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัส กรมวิทยาศาสตร์การอาหารกลางมหาวิทยาลัยของ Lavras (Lavras, MG) ตัวอย่างดีติดป้ายชื่อ ด้วยตัวเลขสุ่มที่สามบนพื้นผิวสีขาว ตัวอย่างเหล่านี้มีแบบ monadic และตามการสมดุลของงานนำเสนอ(Walkeling & Macfie, 1995) ช็อคโกแลตได้นำเสนอใน 50 mLถ้วยพลาสติกประกอบด้วยประมาณ 2.5 g ในแต่ละ หัวข้อrinsed ตามน้ำระหว่างชิม การรับความรู้สึกทำการวิเคราะห์ โดยการอนุมัติของจริยธรรมในท้องถิ่นกรรมการ (กลาง Lavras มหาวิทยาลัย บราซิล)3. ผลลัพธ์3.1 การวิเคราะห์ qPCRหมักแหนมอยู่ และ inoculated ของโกโก้ในฟาร์มมาตราส่วนได้ดำเนินการในการศึกษานี้ ในประเทศ การเริ่มต้นวัฒนธรรมประกอบด้วย S. cerevisiae, P. kluyveri และ H. uvarum ยีสต์ใช้พันธุ์ ลักษณะการทำงานแบบไดนามิกของประชากรของการพันธุ์วัฒนธรรมเริ่มต้นในระหว่างการหมักแหนมโกโก้ใน assays สอง(ควบคุม และ inoculated) ถูกตรวจสอบ โดย qPCR การ ลำดับที่และขนาดของผลิตภัณฑ์ของไพรเมอร์ที่ได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 ตลอดจนพารามิเตอร์ qPCR ที่ได้มาตรฐานเส้นโค้ง เส้นโค้งมาตรฐานก่อตั้งขึ้นในแต่ละชุดไพรเมอร์ ที่ประสิทธิภาพของปฏิกิริยาที่อยู่ในช่วงระหว่าง 88% (P. kluyveri) 96%(S. cerevisiae) กับ reproducibility สูง ตรวจสอบวงเงินต่ำสุดมี 102 เซลล์ mL1. แสดงให้เห็นว่าการวิเคราะห์โค้งละลายใน PCR แต่ละตัวเดียวสูงสุด (ข้อมูลไม่แสดง)การ yeasts S. cerevisiae, P. kluyveri และ H. uvarumและ quantified ในระหว่างการควบคุมและการหมักแหนมโดย inoculatedqPCR (Fig. 1) S. cerevisiae กันในการหมักแหนมทั้งอย่างไรก็ตาม ในการควบคุม ประชากรถูกล่าง (ตั้งแต่ 4.45.9 การล็อก เซลล์/g) กว่าใน (ตั้งแต่หมัก inoculated6.7 การ 7.9 ล็อก เซลล์/g) ในการควบคุม ประชากรของ H. uvarum และP. kluyveri อยู่ในช่วงจาก 3.4 4.5 ล็อก เซลล์/g และ 2.8-3.7 ล็อก เซลล์/gตามลำดับ ในขณะที่พบในการทดสอบ inoculated, P. kluyveriประชากรสูงกว่าในการควบคุม (3.6e5.0 ล็อกเซลล์/กรัม) และH. uvarum แสดงให้เห็นว่าประชากรคล้ายคลึง (3.6e4.5 ล็อกเซลล์/กรัม) มันเป็นคาดว่า จะพบสูงกว่าประชากรพันธุ์ในการหมัก inoculated กว่าควบคุม อย่างไรก็ตามนี้ไม่ใช่สำหรับ H. uvarum เหมือนที่อื่น ๆ yeastsส่วนใหญ่ S. cerevisiae พบตัวเลขสูงสุดอาจยับยั้งการH. uvarum เจริญเติบโต3.2. คาร์โบไฮเดรต เอทานอล และกรดอินทรีย์ระหว่างโกโก้หมักคาร์โบไฮเดรต เอทานอล และกรดอินทรีย์ที่วัดได้จากเยื่อและเมล็ดในระหว่างการหมักแหนมโกโก้ (Figs. 2 และ 3)ความเข้มข้นของ 168 h และ 0 จะแสดงอยู่ในตารางที่ 2 สำหรับการเยื่อกระดาษ ความเข้มข้นเริ่มต้นของกลูโคส ฟรักโทส และกรดซิตริกมีประมาณ 25, 30 และ 90 กรัม/กก. ตามลำดับ ปริมาณการใช้สารเหล่านี้ถูกพบครั้งแรกของหมัก (จนถึงประมาณ 70 h) และคาร์โบไฮเดรตใช้ได้เร็วขึ้นในหมัก inoculated กว่าในตัวควบคุม(Fig. 2) ใน 24 ชมของหมักดอง น้ำตาลกลูโคสลดลงค่าของ13.8 g/kg (ควบคุม) และ 5.4 g/kg (inoculated), และฟรักโทสพบตารางที่ 1ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้สำหรับวิเคราะห์ qPCR qPCR พารามิเตอร์ของเส้นโค้งมาตรฐานที่ได้จากการเจือจาง 10-fold ของยีสต์ดีเอ็นเอ โดย qPCRพันธุ์ไพรเมอร์ qPCR พารามิเตอร์ขนาดผลิตภัณฑ์ลำดับชื่อ R2 ประสิทธิภาพ Slope (%)Cerervisiae S. SC-5fw 50-AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAG-30 215 bp 0.999 3.420 96SC-3bw 50-TGAAATGCGAGATTCCCCT-30P. kluyveri PK-5fw 50-AGTCTCGGGTTAGACGT-30 169 bp 0.998 3.634 88PK-3bw 50-GCTTTTCATCTTTCCTTCACA-30H. uvarum หู-5fw 50-GGCGAGGATACCTTTTCTCTG-30 172 bp 0.998 3.515

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การหมักและการสุ่มตัวอย่างการทดลองหมักได้ดำเนินการในหุบเขาทำฟาร์มโกโก้Juliana ในIgrapiúnaเฮียประเทศบราซิล ฝักโกโก้สุกจาก PS1319 ไฮบริด (ปอร์โตเซกูโร, Uruçuca, BA, บราซิล) เก็บเกี่ยวในเดือนพฤศจิกายน2013 ฝักโกโก้ถูกเปิดด้วยตนเองกับอ้อยและถั่วถูกย้ายทันทีที่บ้านหมัก หมักเริ่มต้นประมาณ 4 ชั่วโมงหลังจากการทำลายของฝักและถูกดำเนินการใน0.06 m3 กล่องไม้ หมักแต่ละใช้ 100 กิโลกรัมของเมล็ดโกโก้. หมักแหนมได้ดำเนินการทั้งที่มีและไม่มีการฉีดวัคซีน(ควบคุม) ของเชื้อยีสต์ผสมที่มีเอส cerevisiae UFLA CA11 (LNF- CA11, LNF ละตินอเมริกา Bento Gonçalves, Rio Grande do Sul, ประเทศบราซิล ) Pichia kluyveri UFLA YCH194 และ Hanseniaspora uvarum UFLA YCH203 ที่จุดเริ่มต้นของกระบวนการ พี kluyveri และเอช uvarum สายพันธุ์ปลูกแยกต่างหากใน YPD น้ำซุป [10 กรัม / ลิตรสารสกัดจากยีสต์ (เมอร์ค); 20 กรัม / ลิตรเปปโตน (HIMEDIA); 20 g / L เดกซ์โทรส (เมอร์ค)] วันที่ 30 C และ 150 รอบต่อนาทีและการจำลองแบบทุก 24 ชม. เซลล์ถูกกู้คืนโดยการหมุนเหวี่ยง (7000 รอบต่อนาที, 10 นาที) และอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน1 ลิตรน้ำเปปโตนหมัน [1 กรัม / L เปปโตน(HIMEDIA)] วิธีการแก้ปัญหานี้ได้แผ่กระจายไปทั่วเมล็ดโกโก้ถึงความเข้มข้นประมาณ 105 เซลล์ / กรัมของโกโก้ เอส cerevisiae UFLA ยีสต์ CA11 ซึ่งเป็นที่แห้งโดย LNF ได้รับการชั่งน้ำหนัก(ตามคำแนะนำตามคำแนะนำของผู้ผลิต) และผสมในการแก้ปัญหาที่มียีสต์อื่นๆ ในการเข้าถึงประชากรประมาณ107 เซลล์ / กรัมของโกโก้ หมักแหนมทั้งหมดได้รับการประเมินในช่วง 168 ชั่วโมงและตัวอย่างประมาณ 100 กรัมแต่ละถูกถอนออกที่0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 และ 168 ชั่วโมงของกระบวนการ กลุ่มตัวอย่างถูกนำตัวประมาณ 40 ซม. จากพื้นผิวของศูนย์กลางของมวลโกโก้หมักที่วางไว้ในการฆ่าเชื้อกระถางพลาสติกและโอนไปยังห้องปฏิบัติการ กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ในการวิเคราะห์ทางเคมีและวัฒนธรรมที่เป็นอิสระถูกเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสการหมักแหนมทั้งหมดได้รับการดำเนินการในการเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.2 การสกัดดีเอ็นเอและปฏิกิริยา qPCR ดีเอ็นเอรวมจากการผลิตเยื่อกระดาษโกโก้ถูกสกัดจากตัวอย่างที่มีดีเอ็นเอ QIAamp Mini Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) ในตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับpurifi- ดีเอ็นเอไอออนบวกจากเนื้อเยื่อ ดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลาใช้งานต่อไป. ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับเอส cerevisiae, พีเอชและ kluyveri uvarum สายพันธุ์ยีสต์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยDíaz, โมลินา, N € ahring และฟิสเชอร์ (2013) และ จะแสดงในตารางที่ 1 ความจำเพาะของแต่ละคู่ไพรเมอร์ได้รับการยืนยันโดยการค้นหาในGenBank โดยใช้ระเบิด (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). PCR แบบ Real-time ได้รับการดำเนินการโดยใช้ Rotor- ยีน Q ระบบ(Quiagen, Hombrechtikon, ZH วิตเซอร์แลนด์) ปฏิกิริยาแต่ละประกอบด้วย 12.5 มิลลิลิตร 2? โรเตอร์-ยีน SYBR สีเขียว PCR โทผสม(Qiagen, Stockach, Konstanz, เยอรมนี) 0.8 มิลลิของแต่ละไพรเมอร์(Invitrogen, S ~ อ่าวเปาโล SP, บราซิล) และดีเอ็นเอแม่แบบมิลลิลิตร 1 สกัดจากเยื่อโกโก้สำหรับปริมาณรวมของ25 มิลลิลิตร ส่วนผสมที่ถูกความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาทีและหลอม / นามสกุลที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาที อุณหภูมิขี่จักรยานเพิ่มขึ้นแล้วโดย 1 C ทุก 5 วินาทีจาก50 C ถึง 99 C จะได้รับโค้งละลาย การวิเคราะห์ทั้งหมดถูกดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า ความเข้มข้นในตัวอย่างดีเอ็นเอที่ถูกจำกัด อยู่ที่ 50 นาโนกรัมต่อการวิเคราะห์ยกเว้นเส้นโค้งมาตรฐานเตรียมจากตัวอย่างที่มีจำนวนที่รู้จักกันของเซลล์ยีสต์ สำหรับเส้นโค้งมาตรฐานสายพันธุ์ยีสต์ทั้งหมดได้รับการปลูกฝังในอาหารเลี้ยงเชื้อ YPD ที่ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์นับโดยใช้ห้อง Neubauer. ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเอ QIAamp Mini Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) และปรับลดลำดับ (01:10) จาก 108 e107 ลงไป10 เซลล์ / มิลลิลิตร จุดบนเส้นโค้งการสอบเทียบแต่ละวัดในเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.3 คาร์โบไฮเดรต, แอลกอฮอล์และการวิเคราะห์กรดอินทรีย์คาร์โบไฮเดรต(กลูโคสและฟรุกโตส), กรดอินทรีย์ (อะซิติกแลคติกและกรดซิตริก) และเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (เอทานอล) จากเยื่อโกโก้และถั่วถูกสกัดและวิเคราะห์โดยใช้ของเหลวchromatography ระบบ (Shimadzu รุ่น LC -10Ai, Shimadzu คอร์ปญี่ปุ่น) พร้อมกับระบบตรวจจับคู่ประกอบด้วย UVeVis ตรวจจับ (SPD 10Ai) และเครื่องตรวจจับดัชนีหักเห (RID-10Ai) Shimadzu คอลัมน์ยกเว้นไอออน (Shim แพ็ค SCR-101H, 7.9 มม? 30 เซนติเมตร) เป็นผู้ดำเนินการวันที่ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลาคาร์โบไฮเดรตและแอลกอฮอล์, และ 50 องศาเซลเซียสเป็นกรด กรดเปอร์คลอริก (100 มิลลิเมตร) ถูกใช้เป็นตัวชะในอัตราการไหล0.6 มิลลิลิตร / นาที กรดตรวจพบผ่านการดูดกลืนแสงยูวี (210 นาโนเมตร) ในขณะที่แอลกอฮอล์และคาร์โบไฮเดรตตรวจพบผ่านทางกรมชลประทาน ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่าและสารประกอบของแต่ละบุคคลที่ถูกระบุขึ้นอยู่กับเวลาการเก็บรักษามาตรฐานการฉีดโดยใช้เงื่อนไขเดียวกัน กลุ่มตัวอย่างที่มีความเข้มข้นได้รับการพิจารณาโดยใช้การสอบเทียบภายนอกวิธี เส้นโค้งการสอบเทียบที่ถูกสร้างขึ้นโดยการฉีดที่แตกต่างกันมีความเข้มข้นของมาตรฐานภายใต้เงื่อนไขเดียวกันของตัวอย่างการวิเคราะห์และพื้นที่ที่ได้รับได้รับการวางแผนเชิงเส้นโค้งที่มีสมการที่ใช้ในการประเมินความเข้มข้นของสารในกลุ่มตัวอย่าง(รามอสเดียส, มิเกลและ Schwan, 2014). 2.4 การวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัสของช็อคโกแลตหลังจากการหมักถั่วถูกดวงอาทิตย์ในเรือนกระจกแห้งอบแห้ง. หลังจากนั้นเป็นต้นมาถั่วเมล็ดแห้งจากทั้งสองแตกต่างกันกระบวนการหมัก (การควบคุมและเชื้อ) ที่ถูกส่งสำหรับการผลิตช็อคโกแลตที่Sartori และ Pedroso Alimentos Ltda (เซา ~ Roque, SP, บราซิล) ช็อคโกแลตที่มีโกโก้ 70%. การวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัสของทั้งสองชนิดของช็อคโกแลต (จากการควบคุมและการหมักเชื้อ) ได้รับการดำเนินการโดยใช้การทดสอบยอมรับของผู้บริโภคตามด้วยการตรวจสอบทุกที่สมัคร(CATA) คำถาม การทดสอบได้ดำเนินการในวันที่ 51 ผู้ใหญ่กว่า 18 ปี ผู้เข้าร่วมกิจกรรมเป็น 19.3% และเพศหญิง 80.7% และเป็นผู้บริโภคของช็อคโกแลต สำหรับการทดสอบการยอมรับของผู้บริโภคที่ได้รับการประเมินว่าพวกเขาชอบแต่ละตัวอย่างการใช้ 9 222 NN บาติสตา, et al / LWT - วิทยาศาสตร์การอาหารและเทคโนโลยี 63 (2015) 221e227 จุดขนาดความชอบ (1 ¼ชอบมาก; 2 ¼ชอบมาก; 3 ¼ไม่ชอบปานกลาง 4 ¼ชอบเล็กน้อย 5 ¼ไม่ชอบหรือไม่ชอบ6 ¼ชอบเล็กน้อย 7 ¼ชอบปานกลาง 8 ¼ชอบมาก; 9 ¼ชอบมาก) (หินและ Sidel, 1993) สำหรับคำถาม CATA ที่ผู้บริโภคถูกถามในการประเมินเจ็ดคุณลักษณะทางประสาทสัมผัสและเลือกผู้ที่พวกเขาสมควรที่จะอธิบายช็อคโกแลต. คุณลักษณะที่มีรสเปรี้ยวผลไม้ที่มีรสขมฝาด, กาแฟ, บ๊องและหวาน. การทดสอบได้ดำเนินการในกระท่อมปิดที่มี ไฟส่องสว่างสีขาวที่ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ทางประสาทสัมผัส, อาหารกรมวิทยาศาสตร์มหาวิทยาลัยสหพันธ์ Lavras (Lavras, MG) กลุ่มตัวอย่างที่ถูกกำกับด้วยตัวเลขสามหลักสุ่มบนพื้นผิวสีขาว ตัวอย่างเหล่านี้มีรูปแบบและเอกตามลำดับที่มีความสมดุลของงานนำเสนอ(Walkeling และ Macfie, 1995) ช็อคโกแลตที่ถูกนำเสนอใน 50 มลถ้วยพลาสติกที่มีประมาณ2.5 กรัม วิชาล้างปากของพวกเขาที่มีน้ำระหว่างชิม ประสาทสัมผัสการวิเคราะห์ได้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบของจริยธรรมท้องถิ่นคณะกรรมการ(สหพันธ์ Lavras มหาวิทยาลัยบราซิล). 3 ผล3.1 การวิเคราะห์ qPCR ธรรมชาติและเชื้อหมักโกโก้ในฟาร์มขนาดได้ดำเนินการในการศึกษานี้ สำหรับการฉีดวัคซีนที่เริ่มต้นวัฒนธรรมที่มีเอส cerevisiae, พีเอชและ kluyveri uvarum ยีสต์สายพันธุ์ที่ถูกนำมาใช้ ลักษณะการทำงานแบบไดนามิกของประชากรของสายพันธุ์เชื้อในระหว่างการหมักโกโก้ในสองการวิเคราะห์(การควบคุมและการเชื้อ) ได้รับการตรวจสอบโดย qPCR ลำดับและขนาดสินค้าของไพรเมอร์ได้สรุปไว้ในตารางที่1 เช่นเดียวกับพารามิเตอร์ qPCR ได้มาตรฐานเส้นโค้ง เส้นโค้งมาตรฐานเป็นที่ยอมรับสำหรับไพรเมอร์แต่ละชุด ประสิทธิภาพปฏิกิริยาอยู่ระหว่าง 88% (พี kluyveri) และ 96% (เอส cerevisiae) ที่มีการทำซ้ำสูง การตรวจสอบวงเงินต่ำสุดคือ 102 เซลล์ ML1 การวิเคราะห์โค้งละลายสำหรับ PCR แต่ละแสดงให้เห็นว่ายอดเขาเดียว(ไม่ได้แสดงข้อมูล). ยีสต์ S. cerevisiae, พีเอชและ kluyveri uvarum ถูกตรวจพบและวัดในระหว่างการควบคุมและการหมักโดยเชื้อqPCR (รูปที่ 1). S. cerevisiae เป็นที่โดดเด่นในการหมักแหนมทั้งสองแต่ในการควบคุมที่มีประชากรที่ลดลง (4.4 ตั้งแต่ที่จะเข้าสู่ระบบเซลล์5.9 / g) กว่าในการหมักเชื้อ (ตั้งแต่6.7 7.9 ที่จะเข้าสู่ระบบเซลล์ / g) ในการควบคุมประชากรของเอช uvarum และพี kluyveri อยู่ในช่วง 3.4-4.5 ล็อกมือถือ / g และ 2.8-3.7 เข้าสู่ระบบเซลล์ / กรัมตามลำดับ ในขณะที่ในการทดสอบเชื้อพี kluyveri แสดงให้เห็นว่าประชากรที่สูงกว่าในการควบคุม(3.6e5.0 เข้าสู่ระบบเซลล์ / g) และเอช แสดงให้เห็นว่าประชากร uvarum ที่คล้ายกัน (3.6e4.5 เข้าสู่ระบบเซลล์ / g) มันเป็นที่คาดว่าประชากรที่สูงขึ้นของสายพันธุ์นี้จะพบในการหมักเชื้อกว่าในการควบคุม; อย่างไรก็ตามเรื่องนี้ไม่ได้กรณีสำหรับเอช uvarum ดูเหมือนว่ายีสต์อื่น ๆส่วนใหญ่เป็นเอส cerevisiae, ตรวจพบในตัวเลขที่สูงที่สุดอาจยับยั้งเอช การเจริญเติบโต uvarum. 3.2 คาร์โบไฮเดรตเอทานอลและกรดอินทรีย์ในระหว่างโกโก้หมักคาร์โบไฮเดรตเอทานอลและกรดอินทรีย์ถูกวัดจากเยื่อกระดาษและถั่วในระหว่างการหมักโกโก้(มะเดื่อ. 2 และ 3). ความเข้มข้นของพวกเขาที่ 0 และ 168 ชั่วโมงจะแสดงในตารางที่ 2 สำหรับการผลิตเยื่อกระดาษที่ความเข้มข้นเริ่มต้นของกลูโคสฟรุกโตสและกรดซิตริกเป็นประมาณ 25, 30 และ 90 กรัม / กิโลกรัมตามลำดับ การบริโภคของสารเหล่านี้ถูกพบในเวลาเริ่มต้นของการหมัก(จนกระทั่งประมาณ 70 ชั่วโมง) และคาร์โบไฮเดรตถูกบริโภคได้เร็วขึ้นในการหมักเชื้อกว่าในการควบคุม(รูปที่. 2) เวลา 24 ชั่วโมงของการหมักกลูโคสลดลงค่า13.8 กรัม / กิโลกรัม (ควบคุม) และ 5.4 กรัม / กิโลกรัม (เชื้อ) และฟรุกโตสแสดงให้เห็นตารางที่1 ไพรเมอร์เฉพาะใช้ในการวิเคราะห์ qPCR และพารามิเตอร์ qPCR โค้งมาตรฐานที่ได้รับจากการเจือจาง 10 เท่า ของยีสต์สายพันธุ์ DNA โดย qPCR. สายพันธุ์ไพรเมอร์ qPCR พารามิเตอร์ลำดับชื่อขนาดสินค้าR2 ประสิทธิภาพลาด (%) เอส cerervisiae SC-5fw 50 -AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAG-30 215 bp 0.999 3.420 96 SC-3bw 50 -TGAAATGCGAGATTCCCCT-30 พี kluyveri PK-50 5fw -AGTCTCGGGTTAGACGT-30 169 bp 0.998 3.634 88 PK-50 3bw -GCTTTTCATCTTTCCTTCACA-30 เอช uvarum HU-5fw 50 -GGCGAGGATACCTTTTCTCTG-30 172 bp 0.998 3.515

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การหมักและหมักการทดลองสุ่มจำนวนที่หุบเขาทำ

ใกล้โกโก้ฟาร์มใน igrapi ú na Bahia , บราซิล โกโก้ฝักสุก
จาก ps1319 ลูกผสม ปอร์ตูเซกูโร อุระทา UCA , BA , บราซิล ) เป็น harvested
ในเดือนพฤศจิกายน 2013 โกโก้ฝักอยู่ด้วยตนเองเปิด
ด้วยมีดและถั่วได้ทันทีย้ายไป
การหมัก Houseเชื้อเริ่มต้นประมาณ 4 H
หลังจากที่ทำลายของฝักและในการปฏิบัติ 0.06 M3
ไม้กล่อง ในการหมักเมล็ดโกโก้ที่ใช้ 100 กก. .
fermentations ได้ทั้งที่ใส่และไม่ใส่
( ควบคุม ) ของกล้าเชื้อผสมยีสต์ S . cerevisiae
ufla ที่มี ca11 ( lnf - ca11 lnf ลาตินอเมริกา Bento Gon , รวมถึง Alves , Rio Grande ทำ
Sul , บราซิล )pichia kluyveri และ ufla ych194 hanseniaspora
uvarum ufla ych203 ที่จุดเริ่มต้นของกระบวนการ
หน้า kluyveri และ H . uvarum ชนิด ที่ปลูกในน้ำซุปแยก ypd
[ 10 กรัมต่อลิตรและสารสกัดจากยีสต์ ( Merck ) ; 20 g / l ตามลำดับ ( himedia ) ; 20 g /
L เดกซ์โทรส ( Merck ) ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและ 150 รอบต่อนาที และซ้ำทุก 24 h .
เซลล์หายโดยการปั่นเหวี่ยง ( 7 , 000 รอบ / นาที , 10 นาที ) และ
อีกครั้งที่แขวนลอยใน 1 ลิตรปลอดเชื้อเปปโตนน้ำ [ 1 g / l ตามลำดับ
( himedia ) ] โซลูชั่นนี้มีการกระจายไปในเมล็ดโกโก้ ถึง
ความเข้มข้นประมาณ 105 เซลล์ / กรัมของโกโก้
S . cerevisiae ufla ca11 ยีสต์ ซึ่งเป็นโปรตีน โดย lnf ,
ชั่ง ( แนะนําตามคําแนะนําของผู้ผลิต ) และผสมในสารละลายด้วยยีสต์

ถึงประชากรอื่น ๆประมาณ 107 เซลล์ / กรัมของโกโก้ ทั้งหมด fermentations ประเมิน
เป็นเวลา 168 ชั่วโมง , และตัวอย่างของประมาณ 100 g
แต่ละถูกถอนออกที่ 0 , 24 , 48 , 72 , 96 และ 120 , 144 168 ชั่วโมงของ
กระบวนการ จำนวนที่ถ่ายได้ประมาณ 40 ซม. จาก
พื้นผิวของศูนย์กลางของมวลโกโก้หมักไปวางไว้ในกระถางพลาสติกปลอดเชื้อ
และโอนไปยังห้องปฏิบัติการ ตัวอย่าง
เคมีและวัฒนธรรมวิเคราะห์อิสระเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C .
fermentations ทั้งหมดมีการปฏิบัติทั้งสามใบ
2.2 . การสกัดดีเอ็นเอ และ qpcr ปฏิกิริยา
ดีเอ็นเอทั้งหมดจากโกโก้เยื่อสกัดจากตัวอย่าง
กับ qiaamp ดีเอ็นเอมินิชุด ( เพิ่มใน Hilden เยอรมนี ,
) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับดีเอ็นเอ อุ -
ไอออนบวกจากเนื้อเยื่อ ดีเอ็นเอที่เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C
ใช้เพิ่มเติมไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อ S . cerevisiae , หน้า kluyveri และ H . uvarum
ยีสต์สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษา คือ การอธิบายไว้ก่อนหน้า โดย D í az
Molina , N ,
ahring แคร์ และ ฟิชเชอร์ ( 2013 ) และจะแสดงในตารางที่ 1
ความจำเพาะของแต่ละคู่ไพรเมอร์ที่ได้รับการยืนยันโดยการค้นหาใน
ขนาดใช้ระเบิด ( http : / / www.ncbi . nlm . NIH . gov / ระเบิด / )
เวลาจริงโดยมีการใช้ระบบ Q )
( quiagen ใบพัด ,hombrechtikon zh-4 , สวิตเซอร์แลนด์ ) แต่ละปฏิกิริยา
ประกอบด้วย 2  ใบพัดยีน SYBR สีเขียว PCR Master Mix
12.5 มิลลิลิตร ( stockach เพิ่ม , , Konstanz , เยอรมนี ) , 0.8 มม. ของแต่ละคู่ ( Invitrogen , s ~

อ่าว เปาโล , SP , ประเทศบราซิล ) และ 1 มิลลิลิตรสกัดดีเอ็นเอแม่แบบจากโกโก้
เยื่อสำหรับปริมาณ 25 มิลลิลิตร ผสม คือ
อุ่น 95 C 10 นาที ตามด้วย 40 รอบ (
95 C เป็นเวลา 10 วินาทีและการอบอ่อน / ส่วนขยายที่ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 วินาที
จักรยานอุณหภูมิเพิ่มขึ้น 1 องศาเซลเซียส จากนั้นทุก 5 จาก 50 C
99 C ได้รับการหลอมโค้ง ทั้งหมดที่วิเคราะห์ข้อมูล
ดำเนินการทั้งสามใบ ดีเอ็นเอของตัวอย่างได้
( 50 นาโนกรัมต่อการวิเคราะห์ ยกเว้นเส้นโค้งมาตรฐานเตรียม
จากตัวอย่างที่มีรู้จักจำนวนเซลล์ยีสต์ สำหรับ
เส้นโค้งมาตรฐานสายพันธุ์ยีสต์ทั้งหมดที่ปลูกใน ypd วุ้นที่
30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ก็นับใช้นูเบาเออร์ ห้อง
ดีเอ็นเอดีเอ็นเอโดยใช้ qiaamp Mini Kit ( QIAGEN Hilden เยอรมนี , ,
) และเป็นเจือจาง ( 1 : 10 ) จาก 108
農近ลง

10 เซลล์ / มล. ในแต่ละจุดในการสอบเทียบ ทำสำเนาสามฉบับในโค้งได้
.
2.3 คาร์โบไฮเดรต แอลกอฮอล์ และกรดอินทรีย์การวิเคราะห์