The number of Mycoplasma-specific I

The number of Mycoplasma-specific IFN-g secreting cells
(SC) in the peripheral blood of pigs was determined by
ELISpot assay as previously described (Martelli et al., 2009;
Ferrari et al., 2011). Briefly, PBMC isolated by Histopaque-
1.0771 gradient were plated at a density of 8  105 cells/
well in cRPMI supplemented with 10% FBS into 96-well
plates (MultiScreen1
HTS-IP, Millipore, Billerica, MA, USA)
coated overnight at 4 8C with 10 mg/ml anti-pig IFN-g mAb
(clone P2G10, IgG1, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA)
and blocked with cRPMI for 2 h at 37 8C. For the in vitro
antigen recall, cells were stimulated with purified bacterins
(inactivated M. hyopneumoniae) at R = 100 bacterins/cells
(50 mg/ml) in cRPMI, for 20 h at 37 8C, 5% CO2. Afterwards,
plates were incubated for 1 h at 37 8C with 0.5 mg/ml antipig
IFN-g biotin-labeled mAb (clone P2C11, BD Pharmingen)
and then with 1:750 AP-conjugated anti-biotin mAb in
PBS + 0.5% BSA (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Plates
were incubated for 7 min at room temperature with a BCIP/
NBT solution (BioRad, Hercules, CA, USA) and the reaction
was stopped with distilled water.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จำนวนเซลล์ที่ซ่อนเฉพาะไก่ IFN-g(SC) ในเลือดของสุกรที่ถูกกำหนดโดยทดสอบ ELISpot ตามที่เคยอธิบายไว้ (ลลิ et al. 2009เฟอร์รารี et al. 2011) สั้น ๆ PBMC แยก โดย Histopaque-1.0771 ไล่ระดับสีถูกชุบที่ความหนาแน่นของเซลล์ 8 105 /ใน cRPMI เสริม ด้วย 10% FBS เป็น 96 หลุมแผ่น (MultiScreen1HTS-IP มิลลิพอร์ Billerica, MA, USA)เคลือบค้างคืนที่ 8C 4 กับ 10 mg/ml ป้องกันหมู IFN-g มาบ(โคลน P2G10, IgG1, BD Pharmingen ทะเลสาบแฟรงคลิน นิวเจอร์ซีย์ สหรัฐอเมริกา)และถูกบล็อค ด้วย cRPMI สำหรับ 2h ที่ 37 8C. สำหรับการในหลอดทดลองเรียกคืน antigen เซลล์ที่ถูกกระตุ้น ด้วยบริสุทธิ์ bacterins(ยก M. hyopneumoniae) ที่ R = 100 bacterins/เซลล์(50 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) ใน cRPMI สำหรับ 20 h ที่ 37 8C, 5% CO2 หลังจากนั้นแผ่นได้รับการกก 1 ชั่วโมงที่ 37 8C กับ antipig 0.5 mg/mlชื่อไบโอตินมาบ IFN-g (โคลน P2C11, BD Pharmingen)แล้วกับ 1:750 ผัน AP ไบโอตินต้านมาบในPBS + 0.5% บีเอสเอ (เวกเตอร์ Labs เบอร์ลินเกม CA, USA) แผ่นได้รับการกก 7 นาทีที่อุณหภูมิห้องด้วยเครื่อง BCIP /ปฏิกิริยาและการแก้ไขปัญหา NBT (BioRad เฮอร์คิวลิส CA, USA)ถูกหยุด ด้วยน้ำกลั่น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จำนวนของเซลล์ IFN-G หลั่ง Mycoplasma เฉพาะ
(SC) ในเลือดของสุกรถูกกำหนดโดย
ELISPOT ทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (เท et al, 2009;.
. เฟอร์รารี et al, 2011) สั้น ๆ , PBMC แยกโดย Histopaque-
1.0771 ลาดถูกชุบที่มีความหนาแน่นของ 8? 105 เซลล์ /
ดีใน cRPMI เสริมด้วย 10% FBS ลงใน 96 หลุม
แผ่น (MultiScreen1
HTS-IP, คบิลเลริกา, MA, USA)
เคลือบค้างคืนที่ 4 8C 10 mg / ml ป้องกันหมู IFN-G mAb
(โคลน P2G10 , IgG1, BD PharMingen แฟรงคลินทะเลสาบ, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา)
และถูกปิดกั้นด้วย cRPMI เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 8C สำหรับในหลอดทดลอง
การเรียกคืนแอนติเจนเซลล์ถูกกระตุ้นด้วย bacterins บริสุทธิ์
(ยกเลิกเอ็ม hyopneumoniae) ที่ r = 100 bacterins / เซลล์
(50 mg / ml) ใน cRPMI เป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 37 8C, 5% CO2 หลังจากนั้น
แผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 8C 0.5 mg / ml antipig
IFN-G ไบโอตินที่ติดฉลาก mAb (โคลน P2C11, BD PharMingen)
และจากนั้น 1: 750 AP-ผัน mAb ต่อต้านไบโอตินใน
พีบีเอส + 0.5% บีเอสเอ (เวกเตอร์ Labs, เบอร์ลิน, CA, USA) แผ่น
ถูกบ่มเป็นเวลา 7 นาทีที่อุณหภูมิห้องด้วย BCIP /
วิธีการแก้ปัญหา NBT (BioRad ดาว, CA, USA) และการเกิดปฏิกิริยา
ก็หยุดด้วยน้ำกลั่น