2.2. PCR reactions and DNA sequenci

2.2. PCR reactions and DNA sequencing
DNA for PCR ampli¢cations was extracted as described
previously [16]. A phenol chloroform extraction was performed
prior to isopropanol precipitation. PCR was performed
using a Hybaid Touch Down Thermal Cycler. The
50-Wl reactions contained 200 ng of genomic DNA,
40 pmol of each forward T10 (5P-ACG-ATA-GGT-TCACCT-
CCA-GAC-3P) [17] and reverse BT12 (5P-GTT-GTCAAT-
GCA-GAA-GGT-CTC-3P) primers, 100 WM dNTPs,
and 1U Taq polymerase. A hot start PCR was employed
using: initial denaturation at 94‡C for 4 min, ¢ve cycles of
denaturation at 94‡C for 50 s, primer annealing at 47‡C
for 50 s, and primer extension at 72‡C for 1min. This was
followed by an additional 30 cycles of denaturation at
94‡C for 50 s, primer annealing at 55‡C for 50 s, and
primer extension at 72‡C for 1min . Final chain elongation
was 72‡C for 10 min.
Templates for sequencing reactions were ampli¢ed as
described above and puri¢ed from 1% agarose gels using
a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). PCR products
were ligated to pCR-II0 TOPO (Invitrogen). Sequencing
of both strands was carried out using an ABI Prism1
BigDye1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
kit (PE Applied Biosystems). Sequencing products were
analyzed at the UBC Nucleic Acid and Protein Service
Laboratory (University of British Columbia, Vancouver,
BC, Canada) on an ABI 373 DNA sequencer (PE Applied
Biosystems). Direct sequencing was performed using the
primers T8 (5P-GAC-CGA-AGA-TGA-AGT-TGT-CG-
3P), B610F (5P-GGA-GCG-CAT-GAA-CGT-CTA-(T/C)-
TT-3P) and B706R (5P-ATG-ATG-AGA-CT(C/A)-G-
(G/A)C-GAT-GC-3P). Plasmid ligated templates were sequenced
using the M13 forward and reverse primers.
2.3. Phylogenetic analysis
The ampli¢ed DNA sequences were compared to other
published L-tubulin sequences in GenBank using the
BLASTN search engine at the National Center of Biotechnology
Information website (National Library of
Medicine, Bethesda, MD, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/). Nucleotide sequences were aligned using an online

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 ปฏิกิริยา PCR และลำดับดีเอ็นเอ
ดีเอ็นเอสำหรับ PCR Ampli ¢ประจุบวกถูกสกัดตามที่อธิบายไว้
ก่อนหน้านี้ [16] สกัดคลอโรฟอร์มฟีนอลที่ได้ดำเนินการ
ก่อนที่จะมีการเร่งรัด isopropanol PCR ได้ดำเนินการ
โดยใช้ Hybaid สัมผัสความร้อนลง Cycler
ปฏิกิริยา 50 Wl มีอยู่ 200 ng ของดีเอ็นเอ,
40 pmol ของแต่ละข้างหน้า T10 (5P-ACG-ATA-GGT-TCACCT-
CCA-GAC-3P) [17] และย้อนกลับ BT12 (5P-GTT-GTCAAT-
GCA- GAA-GGT-CTC-3P) ไพรเมอร์ 100 WM dNTPs,
และ 1U Taq polymerase PCR เริ่มร้อนถูกจ้าง
โดยใช้: denaturation เริ่มต้นที่ 94 ‡เซลเซียสเป็นเวลา 4 นาที, ¢และรอบของการ
สูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ‡ C เป็นเวลา 50 วินาที, อบไพรเมอร์ที่ 47 ‡ C
50 วินาที, และการขยายไพรเมอร์ที่ 72 ‡เซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที . นี้ถูก
ตามด้วยอีก 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่
94 ‡ C เป็นเวลา 50 วินาที, อบไพรเมอร์ที่ 55 ‡ C เป็นเวลา 50 วินาที, และ
ขยายไพรเมอร์ที่ 72 ‡เซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที ห่วงโซ่การยืดตัวสุดท้าย
เป็น 72 ‡เซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที.
แม่แบบสำหรับปฏิกิริยาลำดับเป็นเอ็ด¢ Ampli ที่
อธิบายไว้ข้างต้นและ Puri ¢เอ็ดจากเจล agarose 1% โดยใช้
การสกัดเจล QIAquick Kit (Qiagen) ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์
ถูก ligated เพื่อ PCR-II0 TOPO (Invitrogen) ลำดับ
ของเส้นทั้งสองได้รับการดำเนินการโดยใช้ ABI Prism1
BigDye1 Terminator วงจรลำดับพร้อมปฏิกิริยา
ชุด (PE Applied Biosystems) ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการจัดลำดับ
การวิเคราะห์ที่ยูบีซีนิวคลีอิกและกรดโปรตีนบริการ
ห้องปฏิบัติการ (มหาวิทยาลัยบริติชโคลัมเบีย, แวนคูเวอร์,
บริติชโคลัมเบีย, แคนาดา) ในซีเควนดีเอ็นเอ ABI 373 (PE Applied
Biosystems) ลำดับโดยตรงได้รับการดำเนินการโดยใช้
ไพรเมอร์ T8 (5P-GAC-CGA-AGA-TGA-AGT-TGT-CG-
3P) B610F (5P-GGA-GCG-CAT-GAA-CGT-CTA- (T / C) -
TT-3P) และ B706R (5P-ATG-ATG-AGA-CT (C / A) -G-
(G / A) C-GAT-GC-3P) พลาสมิด ligated แม่แบบมีลำดับขั้นตอน
การใช้ M13 ไปข้างหน้าและย้อนกลับไพร.
2.3 การวิเคราะห์วิวัฒนาการ
เอ็ด¢ Ampli ลำดับดีเอ็นเอถูกนำมาเปรียบเทียบกับคนอื่น ๆ
ที่เผยแพร่ลำดับ L-tubulin ใน GenBank โดยใช้
เครื่องมือค้นหาไทด์ที่ศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติของ
เว็บไซต์สารสนเทศ (หอสมุดแห่งชาติ
แพทยศาสตร์ Bethesda, MD, USA, http: // www ncbi.nlm.nih.
gov /) ลำดับเบสถูกจัดชิดโดยใช้ออนไลน์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . ปฏิกิริยา PCR และการหาลำดับเบส DNA PCR ampli ¢

ทำให้ดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 16 ] เป็นฟีนอลด้วยการสกัดการ
ก่อนที่จะตกตะกอนไอโซโพรพานอล . การใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
สัมผัส hybaid ลง Thermal cycler .
50 ชุดปฏิกิริยาของ genomic DNA ที่มีอยู่ 200 นาโน , 40 pmol ของแต่ละ t10
-
( 5p-acg-ata-ggt-tcacct ไปข้างหน้าcca-gac-3p ) [ 17 ] และย้อนกลับ 12 ( 5p-gtt-gtcaat -
gca-gaa-ggt-ctc-3p ) ไพรเมอร์ , 100 dntps WM , และแท็กการวิด
. เป็นเริ่มร้อนใช้
ใช้ : เริ่มต้นที่ 94 ( ‡ C เป็นเวลา 4 นาที ¢ได้รอบ
( ที่ 94 ‡ C 50 S , ไพรเมอร์ขนาด 47 ‡ C
50 s และแนวทางส่งเสริมที่ 72 ‡ C เป็นเวลา 1 นาที นี้คือ
ตามด้วยอีก 30 รอบ ( ที่
94 ‡ C 50 วินาทีไพรเมอร์อบอ่อนที่อุณหภูมิ 55 ‡ C 50 S ,
primer ส่วนขยายที่ 72 ‡ c สำหรับ 1 นาที . สุดท้ายโซ่ยืด
คือ 72 ‡ C 10 นาที
แม่แบบสำหรับปฏิกิริยาการเป็น ampli ¢ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและปุริม
¢เอ็ดจาก 1% , เจลใช้
เป็น qiaquick เจลสกัดชุด ( เพิ่ม ) ผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกผูกเพื่อ pcr-ii0 Topo ( Invitrogen ) ลำดับ
ทั้งเส้นมีการใช้อบิ prism1
bigdye1 Terminator รอบลำดับชุดปฏิกิริยา
พร้อม ( PE Applied Biosystems ) ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวถูก
วิเคราะห์ที่ยูบีซีกรดนิวคลีอิกและโปรตีน ( ห้องปฏิบัติการบริการ
มหาวิทยาลัยบริติชโคลัมเบียแวนคูเวอร์
ก่อนคริสต์ศักราช , แคนาดา ) ใน DNA sequencer ABI 373 ( PE ใช้
Biosystems ) โดยอาศัยการวิเคราะห์การใช้ไพรเมอร์ ( 5p-gac-cga-aga-tga-agt-tgt-cg T8
-
3 p )b610f ( 5p-gga-gcg-cat-gaa-cgt-cta - ( t / c )
tt-3p ) และ b706r ( 5p-atg-atg-aga-ct ( C / A ) - g -
( G / A ) c-gat-gc-3p ) พลาสมิด ผูกเป็นลำดับ
แม่แบบโดยใช้ M13 ไปข้างหน้าและย้อนกลับด้วย .
2.3
วิเคราะห์ phylogenetic ที่ ampli ¢เอ็ดลำดับดีเอ็นเอเปรียบเทียบกับอื่น ๆที่พบ l-tubulin

blastn ลำดับการใช้เครื่องมือค้นหาที่ศูนย์แห่งชาติของเทคโนโลยีชีวภาพ
ข้อมูลเว็บไซต์ ( หอสมุดแห่งชาติ
ยา , Bethesda , MD , อเมริกา , http : / / www.ncbi . nlm . nih gov .
/ ) ลำดับนิวคลีโอไทด์ ชิดแบบออนไลน์