The first of two PCRs (Figure 1A) c

The first of two PCRs (Figure 1A) creates a linear insert with plasmid sequences at both ends (see Supplementary Materials for methods and instructions for primer design). These extensions subsequently allow the strands of the PCR product (Figure 1A) to act as a pair of oversized primers on the vector fragment (Figure 1B). After denaturation and annealing, the insert strands hybridize to the vector and extend to form new double-stranded plasmid. Phusion DNA polymerase (Cat. no. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), crucial for performance of the technique, does not possess strand displacement activity. Therefore, the final product of the reaction is a double stranded fusion plasmid with two nicks (one on each strand). This relaxed double-stranded plasmid is then transformed into competent Escherichia coli cells, which seal the nicks with DNA repair enzymes (Figure 1C). We employ the same thermostable polymerase for both PCRs, so inexperienced users can clone efficiently without mastering the idiosyncrasies of multiple restriction enzymes, polymerases, glycosylases, recombinases, and ligases.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ครั้งแรกของสอง PCRs (รูปที่ 1a) สร้างแทรกเชิงเส้นที่มีพลาสมิดลำดับที่ปลายทั้งสอง (ดูวัสดุเสริมสำหรับวิธีการและคำแนะนำสำหรับการออกแบบไพรเมอร์) ส่วนขยายเหล่านี้ก็ช่วยให้เส้นของผลิตภัณฑ์ pcr (รูปที่ 1a) จะทำหน้าที่เป็นคู่ของไพรเมอร์ขนาดใหญ่ในส่วนเวกเตอร์ (รูปที่ 1b) หลังจาก denaturation และการหลอม,ใส่เส้นผสมพันธุ์เวกเตอร์และขยายในรูปแบบพลาสมิดเกลียวคู่ใหม่ Phusion dna โพลิเมอร์ (แมวไม่มีฉ-530. Biolabs อังกฤษใหม่ Ipswich ma, usa) สิ่งสำคัญสำหรับการทำงานของเทคนิคไม่ได้มีกิจกรรมการกำจัดสาระ ดังนั้นผลิตภัณฑ์สุดท้ายของปฏิกิริยาฟิวชั่นเป็นพลาสมิดที่สองติดกับสองชื่อเล่น (หนึ่งในแต่ละกลุ่มสาระ)พลาสมิดนี้เกลียวคู่ที่ผ่อนคลายจะเปลี่ยนแล้วเป็นอำนาจ Escherichia coli เซลล์ซึ่งประทับตราชื่อเล่นด้วยเอนไซม์ซ่อมแซมดีเอ็นเอ (ภาพที่ 1c) เราจ้างโพลิเมอร์ร้อนเหมือนกันสำหรับ PCRs ทั้งผู้ใช้มือใหม่ให้สามารถโคลนได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่ต้องเรียนรู้นิสัยของเอนไซม์หลายข้อ จำกัด polymerases, glycosylases, recombinases และ ligases

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ครั้งแรกของสอง PCRs (รูปที่ 1A) สร้างแทรกเส้น มี plasmid ลำดับที่ปลายทั้งสอง (ดูวัสดุเสริมสำหรับวิธีและคำแนะนำสำหรับการออกแบบพื้น) ส่วนขยายเหล่านี้อนุญาตให้ strands ของผลิตภัณฑ์ PCR (รูปที่ 1A) เป็นคู่ไพรเมอร์ขนาดใหญ่บนส่วนเวกเตอร์ (รูปที่ 1B) ในเวลาต่อมา Denaturation และการอบเหนียว strands แทรกคือการเวกเตอร์ และขยายไปยังแบบฟอร์มใหม่ double-stranded plasmid Phusion ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Cat. ไม่ F-530 BioLabs นิวอิงแลนด์ อิปสวิช MA, USA), สำหรับประสิทธิภาพของเทคนิค มีกิจกรรมแทนสาระสำคัญ ดังนั้น ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของปฏิกิริยาเป็น plasmid ฟิวชั่นคู่ตกค้างกับ nicks สอง (หนึ่งในแต่ละสาระ) นี้ผ่อนคลาย stranded คู่แล้วมีเปลี่ยน plasmid เป็นอำนาจ Escherichia coli เซลล์ ที่ประทับตรา nicks ด้วยเอนไซม์ซ่อมแซมดีเอ็นเอ (รูปที่ 1C) เราใช้พอลิเมอเรสเดียว thermostable สำหรับทั้ง PCRs ดังนั้นสิ่งที่ผู้ใช้สามารถคัดลอกได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่ต้องเรียนรู้ idiosyncrasies หลายเอนไซม์จำกัด polymerases, glycosylases, recombinases และ ligases

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ครั้งแรกของทั้งสอง pcrs (รูปที่ 1 )สร้างใส่ตามแนวยาวพร้อมด้วยลำดับ plasmid ที่ปลายสายทั้งสองด้าน(ดูที่เอกสารเพิ่มเติมสำหรับคำแนะนำและวิธีการในการออกแบบ Primer ) ส่วนต่อขยายนี้ต่อมาอนุญาตให้เกลียวของ ผลิตภัณฑ์ pcr (รูปที่ 1 )ให้ทำหน้าที่เป็นคู่ของ primers ขนาดใหญ่บนกระเบื้องถ้วยกะลาแตกเวกเตอร์(รูปที่ 1 b ) หลังจาก annealing และ denaturationใส่ที่ ปลอดภัย เพียงพอไหมกับ Initialization Vector แบบเกลียวและขยายเพื่อไปที่แบบฟอร์ม plasmid ดับเบิลคลิกที่สายตีเกลียวใหม่ ดีเอ็นเอ phusion polymerase ( Cat .ฉบับที่ F -530 New England biolabs อิป์สิชแล้ว mA USA )สิ่งสำคัญยิ่งสำหรับการทำงานของเทคนิคไม่มีกิจกรรมการแทนที่คา. ดังนั้นสุดท้ายของการตอบสนองที่มีการผสมผสาน plasmid สายตีเกลียวคู่ที่พร้อมด้วยสองการบาด(หนึ่งในเกลียวแต่ละตัว)plasmid แบบเตียงนอนเดี่ยวขนาดใหญ่หนึ่งเตียง - สายตีเกลียวที่ผ่อนคลายแห่งนี้จะถูกปรับเปลี่ยนไปสู่เซลล์ริคีอาเจ้าหน้าที่ซึ่งปิดผนึกการบาดที่พร้อมด้วยเอ็นไซม์ซ่อมแซมดีเอ็นเอ(รูปที่ 1 C )แล้ว เราจะใช้ polymerase thermostable เดียวกันสำหรับ pcrs ทั้งสองจึงเป็นไปได้ที่ผู้ใช้ไม่เคยมีประสบการณ์มาก่อนการถอดแบบข้อมูล( Clone )สามารถได้อย่างมี ประสิทธิภาพ โดยไม่อับอายการฝึกทักษะของเอ็นไซม์ข้อจำกัดหลาย polymerases glycosylases recombinases และ ligases