Materials and methodsCells, virus a

Materials and methods
Cells, virus and time-course analysis of MHV infection

HeLa-CEACAM1a (the epithelial carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) and murine fibroblast LR7 cells [42] that were used to propagate and titrate MHV-A59 (mouse hepatitis virus–A59) were maintained in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) containing 10 % fetal calf serum (Thermo, Waltham, MA), 100 IU of penicillin/ml and 100 μg/ml of streptomycin (both from Life Technologies, Rochester, NY). HeLa-CEACAM1a cells were inoculated with MHV-A59 at a moi of 30 [43, 44]. After 30 min, the infected cells were washed and maintained in complete medium. Subsequently, the infected cells and culture supernatants were collected for analysis at 0, 6, 8 h, p.i. When plant extracts were added to the HeLa-CEACAM1a cells, they were added after viral infection and were washed away 1 h later.

Preparation of extracts

Air-dried plant powdered; seeds of Ns, flowers and buds of Ah and peels of Cs were used for extraction (100 g of material of each separately). All extraction experiments were performed by 200 ml ethanol addition onto powders and incubation at room temperature for a 24 h. The extracts were filtered using Whatman filter paper and ethanol was eliminated by rotary vacuum evaporator at 55 °C. The plant extracts were dissolved in 10 ml distilled water.

Quantitative analysis of IL-8 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

ELISA kits were used to detect the human IL-8 according to the user’s manual (Quantikine, ELISA, Human CXCL8/IL-8 Immunoassay, DY208, R&D Systems, Minneapolis, MN). HeLa CEACAM1 cells were treated with 1/50 and 1/100 diluted concentrations of Ns, Ah and Cs extracts. Additionally HeLa CEACAM1 cells were infected with MHV-A59. Infected cells were treated with 1/50 and 1/100 diluted concentrations of Ns, Ah and Cs extracts. Subsequently, culture supernatants were collected at 0, 6, and 8 h post infection to measure IL-8 levels by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Monitoring the extracellular release of the virus

Infected HeLa CEACAM1a supernatants were collected and end point dilutions were made for TCID50 analysis at 6 and 8 h post infection. The amount of virus present in the culture supernatants were evaluated by using LR7 cells and TCID50 values were calculated.

Isolation of total RNA and TaqMan analysis

Total RNA was isolated from the infected cells using RNeasy mini-kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s instructions with subsequent DNaseI treatment on the column. The amount of RNA concentration was determined by spectrometry using a Nanodrop 100 (Thermo Scientific, DE, USA).

cDNA synthesis

Complementary DNA (cDNA) was synthesized by using Qiagen miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen Sample and Assay Technologies, Hilden, Germany) according to manufacturer’s instructions. Mixture of 5× miScript RT buffer and miScript Reverse Transcription mix was prepared at given ratios and 1.25 μl of it was distributed for each reaction. 0.2 μg of RNA samples was added on reaction mixtures and they were incubated at 37 °C for 60 min then at 95 °C for 5 min. Synthesized cDNAs were then diluted 1:5 with low EDTA TE buffer and subsequently transferred on ice block and kept at −20 °C till use.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการเซลล์ ไวรัส และการวิเคราะห์หลักสูตรเวลาติดเชื้อ MHVHeLa-CEACAM1a (epithelial carcinoembryonic ที่เกี่ยวข้องกับการตรวจหาเซลล์ยึดโมเลกุล 1) และมีรักษาเซลล์ murine fibroblast LR7 [42] ซึ่งใช้แพร่กระจาย และ titrate MHV-A59 (เมาส์ตับอักเสบไวรัส-A59) ในดุลเบกโกของแก้ไขอีเกิ้ล (DMEM ซิก St. Louis, MO) ที่ประกอบด้วย 10% ลูกครรภ์รั่ม (เทอร์โม Waltham, MA), 100 IU ของยา เพนนิซิลลิน/ml และ μg 100 ml ของ streptomycin (ทั้งจากชีวิตเทคโนโลยี โรเชสเตอร์ NY ) เซลล์ HeLa CEACAM1a ได้ inoculated กับ MHV A59 ที่อย 30 [43, 44] หลังจาก 30 นาที เซลล์ติดเชื้อถูกล้าง และรักษาในขนาดกลางที่สมบูรณ์ ในเวลาต่อมา supernatants วัฒนธรรมและเซลล์ติดเชื้อถูกเก็บรวบรวมวิเคราะห์ที่ 0, 6, 8 h, p.i. เมื่อมีเพิ่มสารสกัดจากพืช เซลล์ HeLa CEACAM1a จะเพิ่มหลังจากติดเชื้อไวรัส และมีน้ำ 1 h ในภายหลังการเตรียมสารสกัดจากโรงงาน air-dried ผง ใช้สำหรับการสกัดเมล็ดของ Ns ดอกไม้ และอาหารของ Ah และ peels ของ Cs (100 g ของวัสดุแต่ละแยกต่างหาก) มีดำเนินการทดลองสกัดทั้งหมด โดยเพิ่มเอทานอล 200 ml ผงและบ่มที่อุณหภูมิห้องใน 24 ชม ใช้กระดาษกรอง Whatman สารสกัดที่ถูกกรอง และเอทานอลถูกตัด โดย evaporator สิวโรตารี่ที่ 55 องศาเซลเซียส สารสกัดจากพืชที่ละลายในน้ำ 10 มล.กลั่นวิเคราะห์เชิงปริมาณของ IL-8 โดยเอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay (ELISA)ชุด ELISA ที่ใช้ตรวจหา IL-8 มนุษย์ตามคู่มือของผู้ใช้ (Quantikine, ELISA มนุษย์ Immunoassay CXCL8 IL-8, DY208, R & D ระบบ มิ MN) เซลล์ HeLa CEACAM1 ได้รับการรักษากับ 1/50 และ 1/สารสกัด ความเข้มข้นแตกออก 100 Ns, Ah และ Cs นอกจากนี้เซลล์ HeLa CEACAM1 อยู่ติดกับ MHV A59 เซลล์ติดเชื้อได้รับการรักษากับ 1/50 และ 1/สารสกัด ความเข้มข้นแตกออก 100 Ns, Ah และ Cs ในเวลาต่อมา supernatants วัฒนธรรมถูกรวบรวมไว้ที่ 0, 6 และ 8 h ลงเชื้อวัดระดับ IL-8 โดยใช้เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay (ELISA)ตรวจสอบการปล่อยไวรัส extracellularติดไวรัส HeLa CEACAM1a supernatants ถูกเก็บรวบรวม และทำ dilutions จุดสิ้นสุดสำหรับการวิเคราะห์ TCID50 ที่ติดเชื้อ h ลง 6 และ 8 จำนวนไวรัสที่อยู่ใน supernatants วัฒนธรรมถูกประเมินโดย LR7 เซลล์ และมีคำนวณค่า TCID50แยกวิเคราะห์อาร์เอ็นเอและ TaqMan ทั้งหมดอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจากเซลล์ติดเชื้อด้วย RNeasy มินิชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตภายหลังการรักษา DNaseI ในคอลัมน์ จำนวนความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอที่ถูกกำหนด โดย spectrometry ใช้ 100 Nanodrop (วิทยาศาสตร์เทอร์โม DE สหรัฐอเมริกา)การสังเคราะห์ cDNAเสริมดีเอ็นเอ (cDNA) ถูกสังเคราะห์ โดย Qiagen miScript กลับ Transcription Kit (ตัวอย่าง Qiagen และวิเคราะห์เทคโนโลยี Hilden เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ส่วนผสมของ 5 × miScript RT บัฟเฟอร์และ miScript ผสม Transcription กลับถูกเตรียมที่ให้อัตราส่วน และ μl 1.25 ของมันมีการกระจายในแต่ละปฏิกิริยา เข้ามา μg 0.2 อย่างอาร์เอ็นเอน้ำยาผสมปฏิกิริยา และพวกเขาได้ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 60 นาที แล้วที่ 95 ° C สำหรับ 5 นาที Synthesized cDNAs ถูกผสม 1:5 มีบัฟเฟอร์ EDTA TE ต่ำ และต่อมาถูกโอนย้ายในบล็อกน้ำแข็ง แล้วเก็บไว้ที่ −20 ° C จนถึงใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เซลล์ไวรัสและการวิเคราะห์เวลาที่แน่นอนของการติดเชื้อ MHV HeLa-CEACAM1a (เซลล์แอนติเจนที่เกี่ยวข้อง carcinoembryonic เยื่อบุผิวยึดเกาะโมเลกุล 1) และเซลล์ fibroblast LR7 หมา [42] ที่ถูกนำมาใช้ในการเผยแพร่และไทเทรต MHV-A59 (เมาส์โรคไวรัสตับอักเสบ ไวรัส A59) ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน Dulbecco ของดัดแปลง Eagle กลาง (DMEM; Sigma, เซนต์หลุยส์) ที่มี 10% ซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (เทอร์โม, เคมบริดจ์) 100 IU ของยาปฏิชีวนะ / ml และ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร streptomycin ( ทั้งจากไลฟ์เทคโนโลยีโรเชสเตอร์, นิวยอร์ก) เซลล์ HeLa-CEACAM1a ถูกเชื้อด้วย MHV-A59 ที่แลัของ 30 [43, 44] หลังจาก 30 นาที, เซลล์ที่ติดเชื้อถูกล้างและการบำรุงรักษาในระยะกลางที่สมบูรณ์ ต่อจากนั้นเซลล์ที่ติดเชื้อและ supernatants วัฒนธรรมถูกเก็บรวบรวมเพื่อการวิเคราะห์ที่ 0, 6, 8 ชั่วโมง, ปี่เมื่อสารสกัดจากพืชถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ HeLa-CEACAM1a พวกเขาถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากการติดเชื้อไวรัสและล้างออกไป 1 ชั่วโมงต่อมา. การเตรียมสารสกัดจากพืชอากาศแห้งผง; เมล็ดของ NS, ดอกไม้และดอกตูมของ Ah และเปลือกของ Cs ถูกนำมาใช้ในการสกัด (100 กรัมของวัสดุของแต่ละแยกต่างหาก) การทดลองสกัดทั้งหมดถูกดำเนินการโดยนอกจากนี้เอทานอล 200 มลบนผงและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สารสกัดถูกกรองโดยใช้กระดาษกรอง Whatman และเอทานอลถูกกำจัดโดยระเหยสูญญากาศแบบหมุนที่ 55 ° C สารสกัดจากพืชที่ถูกกลืนหายไปใน 10 มิลลิลิตรน้ำกลั่น. การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ IL-8 โดยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงอิมมูโน assay (ELISA) ชุด ELISA ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบ IL-8 ของมนุษย์ตามคู่มือการใช้งาน (Quantikine, ELISA มนุษย์ CXCL8 / IL-8 Immunoassay, DY208, R & D Systems, Minneapolis, MN) HeLa เซลล์ CEACAM1 ได้รับการรักษาด้วย 1/50 และ 1/100 ความเข้มข้นเจือจางของ NS, Ah และสารสกัดจาก Cs นอกจากนี้เซลล์ HeLa CEACAM1 มีการติดเชื้อ MHV-A59 เซลล์ที่ติดเชื้อได้รับการรักษาด้วย 1/50 และ 1/100 ความเข้มข้นเจือจางของ NS, Ah และสารสกัดจาก Cs ต่อมา supernatants วัฒนธรรมถูกเก็บที่ 0, 6, และ 8 ชั่วโมงโพสต์การติดเชื้อในการวัดระดับ IL-8 โดยใช้เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (ELISA). ตรวจสอบการปล่อยเซลล์ของเชื้อไวรัสที่ติดเชื้อ supernatants HeLa CEACAM1a ถูกเก็บรวบรวมและปลายเจือจางจุด ถูกสร้างขึ้นมาสำหรับการวิเคราะห์ TCID50 ที่ 6 และ 8 ชั่วโมงติดเชื้อโพสต์ ปริมาณของเชื้อไวรัสอยู่ใน supernatants วัฒนธรรมได้รับการประเมินโดยใช้เซลล์ LR7 และค่า TCID50 ถูกคำนวณ. แยก RNA ทั้งหมดและการวิเคราะห์ TaqMan รวมอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากเซลล์ที่ติดเชื้อโดยใช้ RNeasy มินิชุด (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิตกับการรักษาภายหลัง DNaseI ในคอลัมน์ ปริมาณความเข้มข้นของ RNA ถูกกำหนดโดย spectrometry ใช้ Nanodrop 100 (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ DE, USA). การสังเคราะห์ cDNA Complementary DNA (cDNA) ถูกสังเคราะห์โดยใช้ Qiagen miScript ย้อนกลับถอดความ Kit (Qiagen ตัวอย่างและ Assay Technologies, ฮิลเดน, เยอรมนี) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต ส่วนผสมของ 5 × miScript บัฟเฟอร์ RT และ miScript ย้อนกลับถอดความผสมได้เตรียมที่อัตราส่วนที่กำหนดและ 1.25 ไมโครลิตรของมันถูกกระจายปฏิกิริยาแต่ละ 0.2 ไมโครกรัมตัวอย่าง RNA ของเข้ามาเมื่อผสมปฏิกิริยาและพวกเขาได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาทีแล้วที่ 95 ° C เป็นเวลา 5 นาที cDNAs สังเคราะห์ได้แล้วเจือจาง 1: 5 บัฟเฟอร์ EDTA ต่ำ TE และโอนต่อมาในบล็อกน้ำแข็งและเก็บไว้ที่ -20 ° C จนถึงการใช้งาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
เซลล์ ไวรัส และแน่นอนเวลาการวิเคราะห์ mhv การติดเชื้อ

hela-ceacam1a ( อาหารที่เกี่ยวข้องกับการบุผิวเซลล์แอนติเจนโมเลกุลและเซลล์ไฟโบรบลาสต์ lr7 1 ) ~ [ 42 ] ที่ใช้ในการเผยแพร่ และพื้นที่เพาะปลูก mhv-a59 ( ไวรัสตับอักเสบเมาส์– a59 ) ถูกเก็บรักษาไว้ในดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ; ซิกม่า เซนต์ หลุยส์โม ) ที่มี 10% เซรั่มของลูกวัว ( เทอร์โมเพิ่ง , MA ) 100 IU / ml และμยา streptomycin 100 g / ml ( ทั้งจากเทคโนโลยี ชีวิตในโรเชสเตอร์ , นิวยอร์ก ) hela-ceacam1a เซลล์ปลูกเชื้อด้วย mhv-a59 ที่ มท. 30 43 [ 44 ] หลังจาก 30 นาที เซลล์ที่ติดเชื้อถูกล้างและรักษาในอาหารที่สมบูรณ์ ต่อมาติดเชื้อเซลล์วัฒนธรรม supernatants ถูกรวบรวมเพื่อการวิเคราะห์ที่ 0 , 6 , 8 H , PI เมื่อพืชมีการเพิ่มเซลล์ hela-ceacam1a พวกเขาถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากการติดเชื้อไวรัส และถูกซัดไป 1 ชั่วโมงต่อมา .



อากาศการเตรียมสารสกัดพืชที่แห้งเป็นผง เมล็ดของ NS , ดอกไม้และตาอ่า เปลือกและ CS ที่ใช้ในการสกัด ( 100 กรัมของวัสดุของแต่ละแยกต่างหาก )การทดลองการสกัดทั้งหมดได้ 200 ml เอทานอลนอกจากนี้บนผงและบ่มที่อุณหภูมิห้องสัก 24 ชั่วโมง สารสกัดถูกกรองโดยใช้กระดาษกรอง whatman และเอทานอลถูกระเหยแบบสุญญากาศที่อุณหภูมิ 55 องศา สารสกัดจากพืชถูกละลายในน้ำกลั่น 10 ml .

การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ 8 โดย enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA )

ชุดตรวจสอบ ELISA จำนวน 8 คน ตามคู่มือของผู้ใช้ ( quantikine , ELISA , มนุษย์ cxcl8 / 8 ทาง dy208 & D , r , ระบบ , Minneapolis , MN ) ถึง ceacam1 เซลล์จะถูกกับ 1 / 50 หรือ 1 / 100 เจือจางความเข้มข้นของ NS อาและ CS สารสกัด นอกจากนี้ถึง ceacam1 เซลล์ติดเชื้อ mhv-a59 .เซลล์ที่ติดเชื้อถูกปฏิบัติด้วย 1 / 50 หรือ 1 / 100 เจือจางความเข้มข้นของ NS อาและ CS สารสกัด ต่อมา supernatants วัฒนธรรมการเก็บที่ 0 , 6 และ 8 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ เพื่อวัดระดับนี้โดยโดยวิธี enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA )

ติดตามปล่อยภายนอกเซลล์ของไวรัส

ติดเชื้อถึง ceacam1a supernatants การเก็บรวบรวมและจุดสิ้นสุดวิธีการทำขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ tcid50 ที่ 6 และการติดเชื้อหลัง 8 H . ปริมาณของไวรัสที่มีอยู่ในวัฒนธรรม supernatants ถูกประเมินโดยใช้เซลล์ lr7 tcid50 และคำนวณค่า

แยกผลรวม RNA และ taqman การวิเคราะห์

รวม RNA ถูกแยกจากเซลล์ที่ใช้ rneasy Mini Kit ( QIAGEN Hilden , ,เยอรมนี ) ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ด้วยการรักษา dnasei ตามมาในคอลัมน์ ปริมาณอาร์เอ็นเอของกำหนดโดยวิธีที่ใช้ nanodrop 100 ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , เดอ , USA ) .



ซึ่งยีนสังเคราะห์ DNA ( cDNA ) ถูกสังเคราะห์โดยการเพิ่ม miscript กลับถอดชุด ( เพิ่มตัวอย่างและการทดสอบเทคโนโลยี Hilden , ,เยอรมนี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ส่วนผสม 5 × miscript RT บัฟเฟอร์ และ miscript ย้อนกลับถอดความผสมเตรียมที่ให้อัตราส่วนและ 1.25 μลิตรมันกระจายสำหรับแต่ละปฏิกิริยา 0.2 μกรัมตัวอย่าง RNA ถูกเพิ่มในส่วนผสมของปฏิกิริยาและพวกเขาถูกบ่มที่ 37 องศา C นาน 60 นาทีแล้วที่ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นได้ cdnas เจือจาง 1 :5 กับต่ำ EDTA TE บัฟเฟอร์ และต่อมาย้ายไปบนน้ำแข็งและเก็บไว้ที่ 20 ° C −จนใช้