Purification of tyrosinase by Fast

Purification of tyrosinase by Fast Protein Liquid Chromatography

The supernatant was loaded onto a cation exchange column (SP-Sepharose FF, GE Healthcare, length = 10 cm, diameter = 2.6 cm) and equilibrated with 20 mM sodium acetate, pH 4.5. Bound proteins were eluted with a linear gradient of sodium chloride (0–1 M) at a flow rate of 5 mL/min (see Fig. 1A). All collected fractions were tested photometrically for monophenolase and diphenolase activity. Fractions containing activity were pooled, ultra filtrated (size exclusion membrane of 10 kDa) and centrifuged (4000 rpm, 4 °C) to remove sodium chloride. The protein solution was then applied to a MonoS HR 5/50 Gl column (cation exchange column, GE Healthcare, length = 50 mm, diameter = 5 mm) and eluted with a linear gradient of sodium chloride (0–0.7 M) at a flow rate of 1 mL/min. Two forms were eluted at a conductivity of 13 and 16 mS/cm (see Fig. 1B), respectively. Fractions containing the first and the second eluted protein form were separately pooled and again loaded on the MonoS HR 5/50 Gl column under same conditions for removing further non-target proteins in a final polishing step (see Fig. 1C/D).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำให้บริสุทธิ์ของเนสมาโดยเร็วโปรตีนเหลว ChromatographySupernatant ถูกโหลดลงในคอลัมน์แลกเปลี่ยน (SP Sepharose FF, GE ดูแลสุขภาพ ความยาว = 10 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลาง = 2.6 ซม.) และ equilibrated กับ 20 มม.โซเดียมอะซิเตท pH 4.5 โปรตีนที่ถูกผูกไว้ที่ eluted ด้วยการไล่ระดับสีเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ (0 – 1 M) อัตราไหล 5 มิลลิลิตร/นาที (ดูรูป 1A) เศษส่วนรวบรวมทั้งหมดรับการทดสอบ photometrically สำหรับกิจกรรม monophenolase และ diphenolase เศษส่วนที่ประกอบด้วยกิจกรรมได้พู ultra filtrated (ยกเว้นเยื่อขนาดของ 10 kDa) และผลิตภัณฑ์ (4000rpm, 4 ° C) การเอาโซเดียมคลอไรด์ โซลูชั่นโปรตีนนำมาใช้กับคอลัมน์ Gl MonoS HR 5/50 (แลกเปลี่ยนคอลัมน์ การแพทย์ GE ยาว = 50 มม. เส้นผ่านศูนย์กลาง = 5 มม.) และ eluted ด้วยการไล่ระดับสีเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ (0 – 0.7 เมตร) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาที สองรูปแบบมี eluted ในการนำของ 13 และ 16 mS/cm (ดูรูป 1B), ตามลำดับ เศษส่วนที่ประกอบด้วยโปรตีน eluted ฟอร์มสองแรกแยกพู และโหลดบนคอลัมน์ Gl MonoS HR 5/50 ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันอีกครั้ง สำหรับเอาเพิ่มเติมเป้าหมายไม่ใช่โปรตีนในขัดขั้นสุดท้ายขั้นตอน (ดูรูป 1C/D)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของเอนไซม์ tyrosinase โดยโปรตีนด่วน Liquid Chromatography

ใสถูกโหลดลงในคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน (SP-Sepharose FF, GE Healthcare, ความยาว = 10 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลาง = 2.6 ซม.) และ equilibrated กับ 20 มิลลิเมตร acetate โซเดียมค่า pH 4.5 โปรตีนที่ถูกผูกไว้กับถูกชะลาดเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ (0-1 เมตร) ที่มีอัตราการไหล 5 มิลลิลิตร / นาที (ดูรูป. 1A) เศษส่วนทั้งหมดที่เก็บรวบรวมได้มีการทดสอบ photometrically สำหรับ monophenolase และ diphenolase กิจกรรม เศษส่วนที่มีกิจกรรมที่ได้รวบรวมพิเศษกรอง (เมมเบรนยกเว้นขนาด 10 กิโลดาลตัน) และหมุนเหวี่ยง (4000 รอบต่อนาที 4 ° C) เพื่อลบโซเดียมคลอไรด์ วิธีการแก้ปัญหาโปรตีนถูกนำมาใช้แล้วคอลัมน์ Monos ทรัพยากรบุคคล 5/50 Gl (คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน, GE Healthcare, ความยาว = 50 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง = 5 มิลลิเมตร) และชะกับลาดเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ (0-0.7 M) ที่ อัตรา 1 มิลลิลิตร / นาทีไหล สองรูปแบบที่ถูกชะที่การนำของ 13 และ 16 MS / ซม. (ดูรูป. 1B) ตามลำดับ เศษส่วนที่มีรูปแบบเป็นครั้งแรกและโปรตีนชะที่สองถูกรวบรวมและแยกอีกครั้งโหลดในคอลัมน์ Monos ทรัพยากรบุคคล 5/50 Gl ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันสำหรับการลบต่อโปรตีนไม่ใช่เป้าหมายในขั้นตอนการขัดสุดท้าย (ดูรูป. 1C / D)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โปรตีนบริสุทธิ์ ไทโรซิเนส โดยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวอย่างรวดเร็วการแลกเปลี่ยนประจุสูงถูกโหลดลงในคอลัมน์ ( SP เกี่ยวข้อง FF , GE Healthcare , ความยาว 10 เซนติเมตร เส้นผ่าศูนย์กลาง = 2.6 ซม. ) และ equilibrated กับอะซีเตทโซเดียม 20 มิลลิเมตร พีเอช 4.5 . ผูกพันโปรตีน มีตัวอย่าง มีความลาดชันเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ ( 0 – 1 M ) ที่อัตราการไหล 5 มิลลิลิตรต่อนาที ( ดูรูปที่ 1 ) ทั้งหมดเก็บเศษส่วนวัด photometrically สำหรับ monophenolase และกิจกรรม diphenolase . เศษส่วนที่มีกิจกรรมพิเศษ ( ขนาดไปพู ผลิตเยื่อ 10 kDa ) และไฟฟ้า ( 4000 รอบต่อนาที 4 ° C ) เพื่อเอา โซเดียม คลอไรด์ โปรตีนในสารละลาย แล้วใช้กับไป HR 5 / 50 GL คอลัมน์ ( คอลัมน์ การแลกเปลี่ยนอิออน GE Healthcare , ความยาว = 50 มม. เส้นผ่าศูนย์กลาง = 5 มม. ) และตัวอย่างที่มีความลาดชันเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ ( 0 – 0.7 M ) ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาที สองรูปแบบคือ การนำตัวอย่างที่ 13 และ 16 ms / cm ( เห็นรูป 1B ) ตามลำดับ ส่วนที่ 1 และ 2 ตัวอย่างรูปแบบแยกโปรตีนรวมและอีกครั้งที่โหลดบนไป HR 5 / 50 GL คอลัมน์ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันสำหรับการลบโปรตีนเป้าหมายไม่เพิ่มเติมในขั้นตอนขัดขั้นสุดท้าย ( ดูภาพประกอบ 1C / D )