Yeast plasmids and transformationPl

Yeast plasmids and transformation

Plasmid pUKC1831 is a multicopy plasmid which carries the hsp104K218T/K620T allele under the control of the GAL1 promoter (Ness et al., 2002). Plasmid pUKC2200 was constructed by first using PCR to generate a 2727 bp fragment from plasmid pUKC1828 (Ness et al., 2002) carrying the full coding sequence of the HSP104 gene with a 5′ BamHI site and a 3′ NotI site. This fragment was then cloned downstream of the GAL1 promoter in the plasmid pYES2 (Invitrogen), a multicopy, URA3-based cloning vector. A similar strategy was used to construct plasmid pUKC2212, except that the template for PCR amplification was plasmid pQE70-hsp104E285Q/E687Q (provided by V. Grimminger and S. Walter, Technical University of Munich; Schaupp et al., 2007) and the 3′ restriction site introduced was an XhoI site. All constructs were resequenced to confirm authenticity. Plasmids were introduced into yeast using the standard lithium acetate method (Schiestl and Gietz, 1989).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Plasmids ยีสต์และการเปลี่ยนแปลงPlasmid pUKC1831 เป็น plasmid multicopy ซึ่งมีอัลลีล hsp104K218T/K620T ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GAL1 (เนส et al. 2002) Plasmid pUKC2200 ก่อตั้งขึ้น โดยครั้งแรกใช้ PCR เพื่อสร้างส่วน bp 2727 จาก plasmid pUKC1828 (เนส et al. 2002) แบกลำดับอักษรเต็มของยีน HSP104 ไซต์ BamHI 5 ′และไซต์ NotI 3′ ส่วนนี้คือโคลนแล้วล่องของโปรโมเตอร์ GAL1 ใน plasmid pYES2 (Invitrogen), multicopy, URA3 ตามโคลนเวกเตอร์ กลยุทธ์คล้ายกันถูกใช้เพื่อสร้าง plasmid pUKC2212 ยกเว้นว่าเป็นแม่แบบสำหรับกระบือ plasmid pQE70-hsp104E285Q/E687Q (มาจาก V. Grimminger และ Walter S. มหาวิทยาลัยเทคนิคมิวนิก Schaupp et al. 2007) และแนะนำเว็บไซต์ 3′ จำกัด เป็นเว็บไซต์ XhoI โครงสร้างทั้งหมดได้รับการ resequenced เพื่อยืนยันความถูกต้อง Plasmids ถูกนำเข้าไปในยีสต์โดยใช้วิธีมาตรฐานลิเธียมอะซิเตท (Schiestl และ Gietz, 1989)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พลาสมิดยีสต์และการเปลี่ยนแปลง

พลาสมิด pUKC1831 เป็นพลาสมิด multicopy ซึ่งดำเนินการ hsp104K218T / K620T อัลลีลภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GAL1 ที่ (Ness et al., 2002) พลาสมิด pUKC2200 ถูกสร้างขึ้นเป็นครั้งแรกโดยใช้วิธี PCR ในการสร้างชิ้นส่วน 2,727 bp จากพลาสมิด pUKC1828 (Ness et al., 2002) การดำเนินการลำดับการเข้ารหัสเต็มรูปแบบของยีน HSP104 กับ 5 'BamHI เว็บไซต์และ 3' เว็บไซต์ Noti ชิ้นส่วนนี้ถูกโคลนจากนั้นล่องโปรโมเตอร์ GAL1 ในพลาสมิด pYES2 (Invitrogen) ซึ่งเป็น multicopy, URA3 ตามพาหะ กลยุทธ์ที่คล้ายกันคือใช้ในการสร้างพลาสมิด pUKC2212 ยกเว้นว่าแม่แบบสำหรับขยาย PCR เป็นพลาสมิด pQE70-hsp104E285Q / E687Q (โดยโวลต์ Grimminger และ S. วอลเตอร์, มหาวิทยาลัยเทคนิคมิวนิค Schaupp et al, 2007.) และ 3 'เว็บไซต์แนะนำข้อ จำกัด เป็นเว็บไซต์ XhoI โครงสร้างทั้งหมดถูก resequenced เพื่อยืนยันความถูกต้อง พลาสมิดที่ถูกนำเข้ามาในยีสต์โดยใช้วิธีการมาตรฐานลิเธียมอะซิเตท (Schiestl และ Gietz, 1989)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยีสต์และการเปลี่ยนแปลงพลาสมิดพลาสมิด pukc1831 เป็น multicopy พลาสมิดซึ่งเป็น hsp104k218t / k620t อัลลีลภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ ( gal1 เนส et al . , 2002 ) พลาสมิดที่ถูกสร้างขึ้นโดย pukc2200 แรกโดยใช้ PCR เพื่อสร้างขนาด 727 BP จากพลาสมิด pukc1828 ( เนส et al . , 2002 ) แบกเต็มรหัสลำดับของยีน hsp104 ด้วย BamHI 5 ได้รับเว็บไซต์และพวกเขาเก็บไว้ตรงไหนก็ได้ 3 เว็บไซต์ ชิ้นนี้ถูกโคลนไหลของโปรโมเตอร์ gal1 ในพลาสมิด pyes2 ( Invitrogen ) , multicopy ura3 , ตามโคลนเวกเตอร์ กลยุทธ์ที่คล้ายกันคือใช้เพื่อสร้างพลาสมิด pukc2212 ยกเว้นว่าแม่แบบสำหรับ PCR ( เป็นพลาสมิด pqe70-hsp104e285q / e687q ( โดย V grimminger และ S . วอลเตอร์ มหาวิทยาลัยเทคนิคมิวนิค ; schaupp et al . , 2007 ) และ 3 นั้นเป็น xhoi จำกัดเว็บไซต์ แนะนำเว็บไซต์ โครงสร้างทั้งหมดถูก resequenced เพื่อยืนยันความถูกต้อง พลาสมิดถูกแนะนำในยีสต์ที่ใช้มาตรฐานแบบลิเธียมเตต ( schiestl และ gietz , 1989 )