T-RFLP analysis(i) PCR and digestio

T-RFLP analysis
(i) PCR and digestion. Universal bacterial primers 27F (59-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
39) and 926R [59-CCGTCAATTC(A/
C)TTT(A/G)AGTTT-39] were used to amplify internal fragments
of 16S rRNA genes in the genomic DNA obtained from samples.
Primers 27F und 926R were labelled at their 59 ends with the dyes6-carboxyfluorescein (6-FAM) and 4,7,29,49,59,79-hexachloro-6-
carboxyfluorescein (HEX), respectively. All primers were obtained
from MWG-Biotech. PCR mixtures comprised PCR buffer, 1.5 mM
MgCl2, each deoxynucleoside triphosphate at a concentration of
0.2 mM, each primer at a concentration of 0.2 mM and 1 U Taq
polymerase (Qiagen) in a final volume of 50 ml. The cycling program
was performed using a Perkin-Elmer 2400 thermocycler with the
following conditions: an initial denaturation step at 95 uC for 5 min,
followed by 35 cycles of denaturation for 30 s at 95 uC, annealing for
30 s at 50 uC and elongation for 1 min at 72 uC, with a final additional
elongation step for 7 min at 72 uC. PCR products were analysed on
1% agarose gels stained with ethidium bromide. After purification
using the QIAquick PCR purification kit, PCR products were digested
with HinfI, HhaI and MspI (New England Biolabs). Digestion
reactions were performed separately for 4 h at 37 uC, followed by
treatment for 20 min at 65 uC for enzyme inactivation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์ T RFLP(i) PCR และการย่อยอาหาร ไพรเมอร์แบคทีเรียสากล 27F (59 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -39) และ 926R [59-CCGTCAATTC(A/ค) TTT(A/G) AGTTT-39] ใช้เพื่อขยายส่วนของภายในของ 16S rRNA ยีนในดีเอ็นเอออกมาจากตัวอย่างไพรเมอร์ 27F und 926R ถูกฉลากที่พวกเขาลงท้าย 59 ด้วย dyes6-carboxyfluorescein (6-FAM) และ 4,7,29,49,59,79-hexachloro-6 -carboxyfluorescein (HEX), ตามลำดับ ไพรเมอร์ทั้งหมดได้รับจาก MWG-เทคโนโลยีชีวภาพ ส่วนผสม PCR ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR, 1.5 มม.MgCl2 ละ deoxynucleoside triphosphate ที่ความเข้มข้นของ0.2 mM รองพื้นแต่ละที่ความเข้มข้น 0.2 mM และ 1 U Taqพอลิเมอเรส (Qiagen) ในไดรฟ์ข้อมูลสุดท้ายของ 50 มล. โปรแกรมขี่จักรยานดำเนินการโดยใช้เครื่อง thermocycler เพอร์เอลเมอ 2400 กับการเงื่อนไขต่อไปนี้: ขั้นตอนการแปรสภาพเริ่มต้นที่ 95 uC สำหรับ 5 นาทีตาม ด้วยรอบ 35 ของแปรสภาพสำหรับ 30 s ที่ 95 uC หลอมสำหรับ30 s 50 uC และยืด 1 นาทีที่ 72 uC กับสุดเพิ่มเติมขั้นตอนยืด 7 นาทีที่ 72 uC ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกนำมาวิเคราะห์ในเจล 1% agarose เลอะโบรไมด์ ethidium หลังจากทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดการฟอก QIAquick PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยสลายHinfI, HhaI และ MspI (นิวอิงแลนด์ Biolabs) ย่อยอาหารปฏิกิริยาดำเนินการแยกต่างหากสำหรับ 4 h ที่ 37 uC ตามด้วยการรักษาสำหรับ 20 นาทีที่ 65 uC สำหรับยกเลิกการเรียกเอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิเคราะห์ T-RFLP
(i) PCR และการย่อยอาหาร ไพรเมอร์ยูนิเวอร์แซแบคทีเรีย 27 (59 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
39) และ 926R [59 CCGTCAATTC (A /
C) TTT (A / G) AGTTT-39] ถูกนำมาใช้เพื่อขยายชิ้นส่วนภายใน
ของยีน 16S rRNA ในดีเอ็นเอที่ได้จากตัวอย่าง
ไพรเมอร์ 27 และ 926R มีป้ายที่ 59 ปลายของพวกเขาด้วย dyes6-carboxyfluorescein (6-FAM) และ 4,7,29,49,59,79-hexachloro-6-
carboxyfluorescein (Hex) ตามลำดับ ไพรเมอร์ทั้งหมดที่ได้รับ
จาก MWG เทคโนโลยีชีวภาพ ผสม PCR ประกอบด้วยกันชน PCR 1.5 มิลลิ
MgCl2 แต่ละ triphosphate deoxynucleoside ที่มีความเข้มข้นของ
0.2 มิลลิแต่ละไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้น 0.2 มิลลิเมตรและมี 1 U Taq
โพลิเมอร์ (Qiagen) ในปริมาณสุดท้ายของ 50 มล. โปรแกรมการขี่จักรยาน
ได้รับการดำเนินการโดยใช้เพอร์กินเอลเมอ 2400 thermocycler กับ
เงื่อนไขต่อไปนี้เป็นขั้นตอนที่สูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 95 UC เป็นเวลา 5 นาที
ตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 95 UC หลอมสำหรับ
30 วินาทีที่ 50 UC และการยืดตัว เป็นเวลา 1 นาทีที่ 72 UC ด้วยสุดท้ายเพิ่มเติม
ขั้นตอนการยืดเวลา 7 นาทีที่ 72 UC ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกนำมาวิเคราะห์ใน
1% agarose เจลย้อมด้วย ethidium bromide หลังจากการทำให้บริสุทธิ์
โดยใช้ชุดฟอก QIAquick PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อย
ด้วย HinfI, HhaI และ MspI (นิวอิงแลนด์ Biolabs) การย่อยอาหาร
เกิดปฏิกิริยาได้ดำเนินการแยกต่างหากสำหรับ 4 ชั่วโมงที่ 37 UC ตามด้วย
การรักษาเป็นเวลา 20 นาทีที่ 65 สำหรับ UC ยับยั้งเอนไซม์