Strains and Plasmids. The Saccharom

Strains and Plasmids.
The Saccharomyces cerevisiae expressing yEGFP previously described27 was used, and Micrococcus luteus (ATCC 4698) was obtained from ATCC. The centromeric expression vector p4GM-LYZ was constructed as previously described.37 E. coli strains BW25113 (F-, DE(araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3, LAM-, rph-1, DE(rhaD-rhaB)568, hsdR514), and JW1631-1 (F-, DE(araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3, LAM-, rph-1, DE(rhaD- rhaB)568, hsdR514, and ΔydhA788::kan) were purchased from The Coli Genetic Stock Center at Yale University, Connecticut. ydhA was previously renamed mliC.38 E. coli T7 Shuffle Express was purchased from New England Biolabs.
Model Construction and Library Design.
Using YASARA v13.4.21,39 a single molecule from hLYZ structure 1JWR28 was superimposed on the Ivyc-HEWL cocrystal structure 1GPQ,26 and the HEWL molecules were then deleted. The resulting hLYZ-Ivyc complex was energy minimized using the AMBER99 force field.40 Six residues were selected for mutation based on the modeled interaction between hLYZ and E. coli Ivyc. A ConSurf29 bioinformatics analysis, using default parameters, scored the hLYZ residues at the interface between hLYZ and Ivy for evolutionary conservation. Poorly conserved residues were then examined for interactions with Ivyc. Residues V2, W34, and G37 have close packed van der Waals contacts at the binding interface. Residues K33, R41, and R115 have extensive hydrogen bonding with Ivyc.
Library Construction
A site directed hlyz library, using the NDT degenerate codon at target sites,30 was constructed from synthetic oligonucleotides as described in detail elsewhere.37 The external N- and C-terminal primers included overlap with the EcoRI and XhoI restriction sites in the p416-GAL1-αMF vector.41 The library was cloned into the p416-GAL1-αMF vector by yeast gap repair homologous recombination in the BJ5464::yEGFP S. cerevisiae strain.27 The statistics of library coverage were calculated using the GLUE algorithm.31

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สายพันธุ์และ Plasmids Cerevisiae Saccharomyces แสดง yEGFP ก่อนหน้านี้ใช้ described27 และรำ luteus (ATCC 4698) ได้รับจาก ATCC นิพจน์ centromeric เวกเตอร์ p4GM-LYZ ถูกสร้างขึ้น ตามก่อนหน้านี้ described.37 E. coli สายพันธุ์ BW25113 (F- DE (araD-อาหรับ) 567, lacZ4787 (del):: rrnB-3 ลำ- rph-1, DE (rhaD-rhaB) 568, hsdR514), และ JW1631-1 (F- DE (araD-อาหรับ) 567, lacZ4787 (del):: rrnB-3 ลำ- rph-1, DE (rhaD-rhaB) 568, hsdR514 และ ΔydhA788::kan) ซื้อจากเดอะ Coli พันธุหุ้นศูนย์มหาวิทยาลัยเยล คอนเนตทิคัต ydhA mliC.38 เปลี่ยนชื่อก่อนหน้านี้ E. coli T7 Shuffle Express ถูกซื้อจาก Biolabs นิวอิงแลนด์ได้ แบบก่อสร้างและออกแบบไลบรารี ใช้ YASARA v13.4.21 โมเลกุลเดียวจาก hLYZ โครงสร้าง 1JWR28 ที่วางซ้อนอยู่บน Ivyc HEWL cocrystal โครงสร้าง 1GPQ, 39 26 และโมเลกุล HEWL ถูกแล้วลบ ซับซ้อน hLYZ Ivyc เกิดพลังงานลดใช้ field.40 แรง AMBER99 ที่เลือกตกหกการกลายพันธุ์ขึ้นอยู่กับการโต้ตอบการสร้างแบบจำลองระหว่าง hLYZ และ Ivyc E. coli ได้ วิเคราะห์ bioinformatics เป็น ConSurf29 โดยใช้พารามิเตอร์การเริ่มต้น คะแนนตก hLYZ ที่อินเทอร์เฟซระหว่าง hLYZ และไอวี่สำหรับอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการ งานนำตกได้แล้วตรวจสอบการโต้ตอบกับ Ivyc ตก V2, W34 และ G37 ได้ปิดบรรจุ van der Waals ติดต่อที่อินเทอร์เฟซสำหรับผูก ตก K33, R41 และ R115 มีไฮโดรเจนอย่างละเอียดด้วย Ivyc สร้างไลบรารี ไซต์นำไลบรารี hlyz ใช้รหัสพันธุกรรม degenerate ผู้ที่เว็บไซต์เป้าหมาย 30 ถูกสร้างจากการสังเคราะห์ oligonucleotides อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37 ซ้อนไพรเมอร์ N - และ C-เทอร์มินัลภายนอกรวมกับ EcoRI และไซต์ p416-GAL1-αMF vector.41 รี XhoI จำกัดถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ p416-GAL1-αMF โดยยีสต์ช่วงซ่อมแซม homologous recombination ใน strain.27 cerevisiae BJ5464::yEGFP S. ที่มีคำนวณสถิติของความครอบคลุมของไลบรารีโดยใช้ algorithm.31 กาว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สายพันธุ์และพลาสมิด.
Saccharomyces cerevisiae แสดง yEGFP described27 ก่อนหน้านี้ถูกนำมาใช้และ Micrococcus luteus (ATCC 4698) ที่ได้รับจาก ATCC การแสดงออก centromeric เวกเตอร์ p4GM-LYZ ถูกสร้างไว้ก่อนหน้านี้ described.37 อีโคไลสายพันธุ์ BW25113 (F-, DE (Arad อาหรับ) 567, lacZ4787 (เดล) :: rrnB-3, LAM-, RPH-1, DE ( rhaD-rhaB) 568, hsdR514) และ JW1631-1 (F-, DE (Arad อาหรับ) 567, lacZ4787 (เดล) :: rrnB-3, LAM-, RPH-1, DE (rhaD- rhaB) 568, hsdR514 และΔydhA788 :: กาญจน์) ได้รับซื้อมาจากศูนย์พันธุ Coli หุ้นที่มหาวิทยาลัยเยลเนตทิคัต ydhA ถูกเปลี่ยนชื่อก่อนหน้านี้ mliC.38 เชื้อ E. coli T7 Shu FFL อีด่วนซื้อมาจากนิวอิงแลนด์ Biolabs.
การก่อสร้างแบบจำลองและการออกแบบห้องสมุด.
ใช้ YASARA v13.4.21,39 โมเลกุลเดียวจาก hLYZ โครงสร้าง 1JWR28 ถูกซ้อนทับบน Ivyc-HEWL cocrystal โครงสร้าง 1GPQ 26 และโมเลกุล HEWL ถูกลบแล้ว ผล hLYZ-Ivyc ซับซ้อนพลังงานลดการใช้กำลังไฟ AMBER99 eld.40 หกตกค้างถูกเลือกสำหรับการกลายพันธุ์ขึ้นอยู่กับรูปแบบการทำงานร่วมกันระหว่าง hLYZ และเชื้อ E. coli Ivyc การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ ConSurf29 โดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นคะแนนตกค้าง hLYZ ที่เชื่อมต่อระหว่าง hLYZ ไอวีและการอนุรักษ์วิวัฒนาการ ป่าสงวนตกค้างไม่ดีมีการตรวจสอบแล้วสำหรับการติดต่อกับ Ivyc ตกค้าง V2, W34 และ G37 ได้บรรจุใกล้แวนเดอร์ Waals รายชื่อที่อินเตอร์เฟซที่มีผลผูกพัน ตกค้าง K33, R41 และ R115 มีพันธะไฮโดรเจนอย่างกว้างขวางกับ Ivyc.
ห้องสมุดก่อสร้าง
เว็บไซต์กำกับห้องสมุด hlyz ใช้ codon เลว NDT ที่เว็บไซต์เป้าหมายที่ 30 ถูกสร้างขึ้นมาจาก oligonucleotides สังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37 N- ภายนอกและ C ไพรเมอร์รวม -terminal ทับซ้อนกับ EcoRI และ XhoI เว็บไซต์ข้อ จำกัด ในการ p416-GAL1-αMF vector.41 ห้องสมุดเป็นโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ p416-GAL1-αMFโดยการซ่อมแซมช่องว่างยีสต์รวมตัวกันอีกคล้ายคลึงกันใน BJ5464 :: yEGFP S. cerevisiae สายพันธุ์ 0.27 สถิติของความคุ้มครองที่ห้องสมุดจะถูกคำนวณโดยใช้กาว algorithm.31

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สายพันธุ์และพลาส .
Saccharomyces cerevisiae แสดง yegfp ก่อนหน้านี้ described27 ถูกใช้และ Micrococcus luteus ( ATCC 4698 ) ได้จาก ATCC . การ centromeric เวกเตอร์การแสดงออก p4gm ลิซ ที่ถูกสร้างขึ้นโดย described.37 E . coli สายพันธุ์ bw25113 ( F - , ( Arad อาหรับ ) 325 , lacz4787 ( เดล ) : : rrnb-3 ลำ - , rph-1 de ( rhad rhab ) เอย , hsdr514 ) และ jw1631-1 ( F - , ( Arad อาหรับ ) 325 ,lacz4787 ( เดล ) : : rrnb-3 ลำ - , rph-1 de ( rhad - rhab ) เอย , hsdr514 และΔ ydha788 : : คัน ) ซื้อจากเชื้อพันธุกรรม Stock ศูนย์ที่มหาวิทยาลัยเยล , Connecticut . ydha เคยเปลี่ยนชื่อ mlic.38 E . coli * * 3 ชูffl E บริการซื้อมาจากอังกฤษ biolabs .
รูปแบบการก่อสร้างและห้องสมุดการออกแบบ โดยใช้ yasara v13.4.21
,39 เป็นโมเลกุลเดี่ยว จาก 1jwr28 โครงสร้าง hlyz ซ้อนทับบน ivyc hewl cocrystal โครงสร้าง 1gpq , 26 และ hewl โมเลกุลแล้วลบ ผล hlyz ivyc ซับซ้อนพลังงานลดการใช้ amber99 บังคับจึง eld.40 หกตกค้างได้คัดเลือกการกลายพันธุ์ตามแบบจำลองปฏิสัมพันธ์ระหว่าง hlyz และ E . coli ivyc . การวิเคราะห์รสน consurf29 ,การใช้ค่าพารามิเตอร์ค่าเริ่มต้นได้ hlyz ตกค้างที่เชื่อมต่อระหว่าง hlyz ไอวี่เพื่อการอนุรักษ์และวิวัฒนาการ งานอนุรักษ์ดินจากนั้นตรวจสอบการปฏิสัมพันธ์กับ ivyc . ตกค้าง V2 , w34 และ g37 ได้ปิดบริการแวนเดอวาลส์รายชื่อที่ติดต่อประสาน k33 r41 ตกค้าง , และ r115 มีไฮโดรเจนที่กว้างขวาง เชื่อมกับ ivyc .

สร้างห้องสมุดเว็บไซต์ห้องสมุด hlyz กำกับการ NDT ทราม codon ที่เว็บไซต์เป้าหมาย 30 ถูกสร้างจากโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37 ภายนอก - และไพรเมอร์ซึ่งรวมซ้อนด้วย EcoRI และ xhoi จำกัดเว็บไซต์ใน p416-gal1 เวกเตอร์ -- MF α .41 ห้องสมุดถูกโคลนเข้าไปใน p416-gal1 - α MF เวกเตอร์ซ่อมแซมช่องว่างการเปรียบเทียบยีสต์ใน bj5464 : : yegfp S . cerevisiae strain.27 สถิติที่ครอบคลุมห้องสมุดคำนวณโดยใช้กาว 31
ขั้นตอนวิธี