Bacterial Strains, Growth, and LacY

Bacterial Strains, Growth, and LacY Purification. E. coli T184
(lacZY) transformed with pCS19 plasmid encoding single-
W151C154G LacY with a 6-histidine tag at the C terminus was
grown in 6 liters of Luria–Bertani broth at 30°C containing
ampicillin (100 gml) to an OD600 of 0.6 and induced with 0.5
mM isopropyl 1-thio-
-D-galactopyranoside. Cells were disrupted
by passage through a French pressure cell, and the
membrane fraction was harvested by ultracentrifugation. Membranes
were solubilized by adding DDM to a final concentration
of 2%, and LacY was purified by Co(II) affinity chromatography
using Talon Superflow (BD Biosciences Clontech) as described
(33, 35). Protein eluted with 150 mM imidazole was dialyzed
against 20 mM Tris
HCl, pH 7.50.008% DDM, concentrated by
using a Vivaspin 20 concentrator (30-kDa cutoff; Vivascience,
Hannover, Germany), and stored on ice. As determined by
SDS12% polyacrylamide gel electrophoresis followed by silver
nitrate staining, the preparations contained only a single band
with aMr of 36 kDa. Protein was assayed by using a MicroBCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สายพันธุ์แบคทีเรีย เติบโต และฟอก LacY E. coli T184(lacZ Y) ที่แตกต่าง pCS19 plasmid ที่เข้ารหัสเดียว-ถูก LacY C154G W151 ด้วยแท็ก 6 histidine ที่นัส Cปลูก 6 ลิตรของ Luria – Bertani ซุปที่ 30° C ประกอบด้วยแอมพิซิลลิน (100 g ml) ไปเป็น OD600 อาจ มี 0.5 และ 0.6มม. isopropyl 1-thio-D-galactopyranoside เซลล์ที่อยู่ระหว่างสองวันโดยเส้นทางผ่านเซลล์ดันฝรั่งเศส และเศษเยื่อถูกเก็บเกี่ยว โดย ultracentrifugation เยื่อหุ้มมี solubilized โดย DDM เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย2% และ LacY ได้บริสุทธิ์ โดย chromatography ความสัมพันธ์ Co(II)ใช้ Superflow Talon (BD เวลาออก Clontech) ดังที่(33, 35) โปรตีน eluted ด้วยอิมิดาโซล 150 มม.ถูก dialyzedกับ 20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl, pH 7.5 0.008% DDM เข้มข้นด้วยใช้อาทิตย์หัว Vivaspin 20 (ตัด 30 kDa Vivascienceฮันโนเวอร์ เยอรมนี), และเก็บไว้บนน้ำแข็ง เป็นไปตามElectrophoresis polyacrylamide เจล 12% SDS ตามเงินไนเตรตย้อมสี การจัดเตรียมประกอบด้วยเพียงวงเดียวกับอัมร์ของ 36 kDa โปรตีนถูก assayed โดยการ MicroBCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แบคทีเรียสายพันธุ์การเจริญเติบโตและการทำให้บริสุทธิ์ลูกไม้ เชื้อ E. coli T184
(lacZ? Y?) เปลี่ยนกับการเข้ารหัส pCS19 พลาสมิดเดียว
W151? C154G ลูกไม้กับป้าย 6 ฮิสติดีนที่สถานี C ได้รับการ
ปลูกใน 6 ลิตรของน้ำซุป Luria-Bertani ที่ 30 ° C มี
ampicillin (100? กรัมมล.) เพื่อ OD600 0.6 และเหนี่ยวนำให้เกิดกับ 0.5?
มิลลิ isopropyl 1 thio - - D-galactopyranoside เซลล์ที่ถูกรบกวน
โดยที่ผ่านหย่อมความกดอากาศฝรั่งเศสและ
ส่วนเมมเบรนได้รับการเก็บเกี่ยวโดย ultracentrifugation เยื่อ
ถูกละลายโดยการเพิ่ม DDM จะเข้มข้นสุดท้าย
2% และลูกไม้บริสุทธิ์โดยร่วม (II) โคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิด
โดยใช้กรงเล็บ Superflow (BD ชีววิทยาศาสตร์ Clontech) ตามที่อธิบายไว้
(33, 35) โปรตีนชะ 150 มิลลิ imidazole ถูก dialyzed
กับ 20 มิลลิ Tris HCl ค่า pH 7.5 0.008% DDM, ความเข้มข้นโดยการ?
ใช้ Vivaspin 20 หัว (ตัด 30 กิโลดาลตัน; Vivascience,
ฮันโนเวอร์, เยอรมนี) และเก็บไว้บนน้ำแข็ง ตามที่กำหนดโดย
SDS? polyacrylamide 12% ข่าวคราวตามมาด้วยเงิน
การย้อมสีไนเตรตเตรียมมีเพียงวงเดียว
กับของ AMR? 36 กิโลดาลตัน โปรตีนได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ MicroBCA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรีย , และเลซี่บริสุทธิ์ E . coli t184
( lacz  Y  ) แปลง ด้วย pcs19 พลาสมิดการเข้ารหัสเดียว -
w151  c154g ลูกไม้กับ 6-histidine แท็กที่ C ปลายทางคือ
โต 6 ลิตร และน้ำซุปที่แบร์ตานิลุเรีย 30 ° C (
( 100 กรัม  ampicillin  มิลลิลิตร ) เพื่อ od600 0.6 และ 0.5 และ
อืม isopropyl 1-thio -
- d-galactopyranoside . เซลล์มีการหยุดชะงัก
โดยผ่านมือถือกดฝรั่งเศสและ
เยื่อส่วนเก็บเกี่ยวผลผลิตโดย ultracentrifugation . ถูกสร้างโดยการเพิ่มเยื่อ

DDM ให้ความเข้มข้นสุดท้าย 2% และเลซี่บริสุทธิ์โดย CO ( 2 ) สามารถใช้อุ้งเท้า superflow
6 ( BD BIOSCIENCES clontech ) ตามที่อธิบายไว้
( 33 , 35 ) โปรตีนตัวอย่างกับ 150 มิลลิซิอิมิดาโซล
กับ 20 มิลลิเมตร โดย
HCl , pH 7.5 / 868  % ,เข้มข้นโดย
ใช้ vivaspin 20 หัว ( 30 ) vivascience ตัด ;
, ฮันโนเวอร์ , เยอรมัน ) , และเก็บไว้บนน้ำแข็ง ตามที่กำหนดโดย
SDS polyacrylamide gel electrophoresis  12 % ตามด้วยเงิน
ไนเตรตการย้อมสีการเตรียมที่มีอยู่เพียงหนึ่งวงดนตรี
กับ AMR ของ  36 กิโลดาลตัน ซีรั่มโปรตีนโดยใช้ microbca