2. Methods2.1. PCR of allergen codi

2. Methods
2.1. PCR of allergen coding sequences from oviduct total mRNA
Animal experimentation/sampling was conducted under protocol
AEC1496, approved by the Australian Animal Health Laboratory
(CSIRO-AAHL) Animal Ethics Committee and in accordance with
the Australian code of practice for the care and use of animals for
scientific purposes.
The magnum portion of a fresh oviduct was obtained from an
egg laying hen. Upon extraction from the hen, the oviduct was
chopped into ∼5 mm pieces and stabilised in RNAlater RNA stabilising
reagent. Total mRNA was then extracted from 180 mg
of oviduct using a Oligotex Direct mRNA extraction kit (Qiagen,
Cat.No.:72022), following the manufacturer’s guidelines. Gal d 1,
2 & 4 coding sequences were isolated directly from the total
mRNA using Qiagen OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Cat.No.: 210210).
The forward (F) and the reverse (R) primers for each allergen
were (bold letters represent inserted restriction sites): Gal d 1 F
with XhoI 5
CGCCTCGAGAT GGCCATGGCAGGC-3
, Gal d 1 R with
HindIII 5
-CGCAAGCTTTCAGCATTTTCCAAA ATG-3
, Gal d 2 F with
BamHI 5
-CGCGGATCCATGGGCTCCATCGGTGCA G-3
, Gal d 2 R with
EcoRI 5
-CGCGAATTCTTAA GGGGAAACACATCT-3
, Gal d 4 F with
BamHI 5
-CGCGGATCCATGAGGTCTTTGCTAATC-3
, Gal d 4 R with
EcoRI 5
-CGCGAATTCTCACAGCCGGCAGCCTCT-3
. For PCR amplifi-
cation of Gal d 3, the total RNA was used to produce a cDNA
library using Omniscript Reverse Transcription kit(Qiagen, Cat.No.:
205110). Qiagen LongRange PCR kit (Qiagen, Cat.No.: 206401),
which uses the PCR optimising reagent Q-solution, was used to
amplify the coding sequence from the cDNA library. The primers
used for amplification of Gal d 3 were: Gal d 3 F with XhoI 5
-
CGCCTCGAGATGAAGCTCATCCTCTGC-3 and Gal d 3 R with HindIII
5
-CGC AAGCTTTTACTTGCCCTCAAGGAA-3
. The PCR products were
run on a 1% agarose gel and purified using a MinElute gel extraction
kit (Qiagen, Cat.No.: 28604).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วิธีการ
2.1 PCR ของสารก่อภูมิแพ้เข้ารหัสลำดับจากท่อนำไข่ทั้งหมด mRNA
สัตว์ทดลอง / การสุ่มตัวอย่างได้ดำเนินการภายใต้โปรโตคอล
AEC1496 รับการอนุมัติจากออสเตรเลียสุขภาพสัตว์ในห้องปฏิบัติการ
(CSIRO-AAHL) สัตว์คณะกรรมการจริยธรรมและสอดคล้องกับ
รหัสออสเตรเลียของการปฏิบัติสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ สำหรับ
วัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์.
ส่วน Magnum ของท่อนำไข่สดที่ได้รับจาก
ไข่ไก่ไข่ เมื่อสกัดจากไก่, ท่อนำไข่ถูก
สับเป็นชิ้น ~5 มิลลิเมตรและมีความเสถียรในการรักษาเสถียรภาพ RNAlater RNA
สาร รวม mRNA ถูกสกัดแล้วจาก 180 มก.
ของท่อนำไข่โดยใช้ชุดสกัด Oligotex ตรง mRNA (Qiagen,
Cat.No.:72022) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต D 1 แกลลอน
2 & 4 ลำดับการเข้ารหัสที่แยกได้โดยตรงจากทั้งหมด
mRNA ใช้ Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Cat.No .: 210,210).
ไปข้างหน้า (F) และย้อนกลับ (R) ไพรเมอร์สำหรับแต่ละสารก่อภูมิแพ้
ได้ (ตัวอักษรหนาตัวแทนแทรกเว็บไซต์ข้อ จำกัด ): Gal D 1 F
? กับ XhoI 5
? CGCCTCGAGAT GGCCATGGCAGGC-3
, Gal D 1 R กับ
? HindIII 5
? -CGCAAGCTTTCAGCATTTTCCAAA ATG-3
, Gal D 2 F ด้วย
? BamHI 5
-CGCGGATCCATGGGCTCCATCGGTGCA G- 3
, Gal D 2 R กับ
EcoRI 5?
-CGCGAATTCTTAA GGGGAAACACATCT-3?
, Gal D 4 F กับ
BamHI 5?
-CGCGGATCCATGAGGTCTTTGCTAATC-3?
, Gal D 4 R กับ
EcoRI 5? -CGCGAATTCTCACAGCCGGCAGCCTCT-3? สำหรับวิธี PCR จากเครื่องขยายไอออนบวกของสาว D 3, RNA ทั้งหมดถูกนำมาใช้ในการผลิตยีนห้องสมุดโดยใช้ชุด Omniscript ย้อนกลับถอดความ (Qiagen, Cat.No .: 205,110) ชุด Qiagen longrange PCR (QIAGEN, Cat.No .: 206,401) ซึ่งใช้วิธี PCR การเพิ่มประสิทธิภาพของน้ำยา Q-แก้ปัญหาถูกใช้ในการขยายลำดับการเข้ารหัสจากห้องสมุด cDNA ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยายของสาว D 3 คน: Gal D 3 F กับ XhoI 5? - CGCCTCGAGATGAAGCTCATCCTCTGC-3? และ Gal D 3 R กับ HindIII 5? -CGC AAGCTTTTACTTGCCCTCAAGGAA-3? ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเรียกใช้บน agarose gel ที่ 1% และบริสุทธิ์โดยใช้เจลสกัด MinElute Kit (Qiagen, Cat.No .: 28604)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วิธีการ2.1 . เทคนิคการเข้ารหัส ลำดับจากท่อนำไข่ของสารก่อภูมิแพ้ทั้งหมดสัตว์ทดลอง / ตัวอย่างดำเนินการภายใต้พิธีสารaec1496 ได้รับอนุมัติจากออสเตรเลียสุขภาพสัตว์ทางห้องปฏิบัติการ( csiro-aahl ) สัตว์คณะกรรมการจริยธรรมและเป็นไปตามออสเตรเลียรหัสของการปฏิบัติสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์สำหรับวัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์ในส่วนของท่อนำไข่สด แม็กนั่มที่ได้จากปูไข่ไก่ เมื่อแยกจากไก่ ท่อนำไข่ คือสับเป็นชิ้น∼ 5 มม. และมีความเสถียรใน rnalater 450 .เกิดปฏิกิริยา ของทั้งหมดก็สกัดจาก 180 มก.ของท่อนำไข่ ใช้โดยตรงของ oligotex สกัด ( เพิ่มชุด ,แมว ไม่ . . . . . : 72022 ) ตามแนวทางของผู้ผลิต สาว D 12 & 4 แยกรหัสลำดับโดยตรงจากทั้งหมดใช้ชุดนี้ผลงานของ QIAGEN ( QIAGEN แมว ไม่ . . . . . : 210210 )ไปข้างหน้า ( F ) และถอยหลัง ( R ) ไพรเมอร์สำหรับแต่ละสารก่อภูมิแพ้( ตัวอักษรตัวหนาแสดงแทรกเว็บไซต์ข้อ จำกัด ) : gal F D 1กับ xhoi 5cgcctcgagat ggccatggcaggc-3, สาว D 1 R กับ- 5- cgcaagctttcagcattttccaaa atg-3สาว 2 D , F กับBamHI 5- cgcggatccatgggctccatcggtgca 3สาว 2 D , R กับด้วย 5- cgcgaattcttaa ggggaaacacatct-3GAL 4 F , D กับBamHI 5- cgcggatccatgaggtctttgctaatc-3GAL 4 r , D กับด้วย 5- cgcgaattctcacagccggcagcctct-3. สำหรับ amplifi - ดีเอ็นเอไอออนบวกของกัล D 3 , อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกใช้ในการผลิตสายพันธุ์ห้องสมุดโดยใช้ชุดถอดความย้อนกลับ omniscript ( QIAGEN แมว ไม่ :205110 ) เพิ่ม longrange PCR Kit ( QIAGEN แมว ไม่ . . . . . : 206401 )ซึ่งใช้วิธี PCR ที่ใช้สารเคมี q-solution ซ ,ขยายการเข้ารหัสลำดับจาก cDNA ห้องสมุด ไพรเมอร์ใช้แบบสาว D 3 : D 3 F กับ xhoi 5 แกลลอน-cgcctcgagatgaagctcatcctctgc-3 สาว D 3 R กับสายพันธุ์และ5- CGC aagcttttacttgccctcaaggaa-3. ผลิตภัณฑ์ PCR คือใช้เจลหรือ 1% และทำให้บริสุทธิ์ การใช้ minelute เจลสกัดชุด ( เพิ่ม แมว ไม่ . . . . . : 28604 )