3.2. Construction of an invertase P

3.2. Construction of an invertase P. pastoris overproducer strain
DNA sequencing of the pUC57 plasmid confirmed the correct nucleotide sequences of the invGS gene. The invertase synthetic gene had a full length of 1755 bp. We engineered the DNA sequencetoproduce theA. niger GH1 invertase as amaturepolypeptide of 589amino acids. PCR analysis of the recombinant plasmid, using AOX1
primers, showed a 2188 bp product that confirmed the pPIC9invGS construct.Transformation of P. pastoris KM71 with the SalI-digested pPIC9invGS plasmid gave about 24 His+ transformants. PCR analysis of the genomic DNAs isolated from P. pastoris KM71invGS (His+transformants) showed a 2188-bp band that corresponds to the alpha-factor prepro-secretion signal (255 bp) and synthetic invertase (1725 bp) coding sequences, and fragments of the multiple cloning site from the pPIC9 vector (15 bp), AOX1 promoter (94 bp),and transcription terminator (99 bp).Cell-free culture media from 24 h methanol-induced recombinant strain micro-cultures showed an extracellular protein per cell ranging from 0.31 to 1.87 pg/cell for the 24 recombinant stainstested. The selected P. pastoris KM71invGS strain yielded an extracellular
proteinper cellthat was 6-foldhigher thanthe extracellularprotein per cell determined for the lowest producer strain.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2 การก่อสร้างต้องใช้การ invertase P. pastoris overproducerลำดับดีเอ็นเอของ pUC57 plasmid ยืนยันลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้องของยีน invGS ยีนสังเคราะห์ invertase มีความยาวเต็มของ 1755 bp เราได้วางแผน theA sequencetoproduce ดีเอ็นเอ invertase GH1 ไนเจอร์เป็น amaturepolypeptide กรด 589amino วิเคราะห์ PCR ของ plasmid recombinant ใช้ AOX1ไพรเมอร์ พบผลิตภัณฑ์ bp 2188 ที่ยืนยันโครงสร้าง pPIC9invGSการเปลี่ยนแปลงของ P. pastoris KM71 มี plasmid เจ่าสลี่ pPIC9invGS ให้เขา + transformants ประมาณ 24 วิเคราะห์ PCR ของ DNAs genomic ที่แยกต่างหากจาก P. pastoris KM71invGS (พระ + transformants) แสดงให้เห็นว่าวง 2188 bp ที่สอดคล้องกับสัญญาณการหลั่ง prepro อัลฟาปัจจัย (255 bp) และสังเคราะห์ invertase (1725 bp) รหัสลำดับ และชิ้นส่วนของไซต์ cloning หลายเวกเตอร์ pPIC9 (15 bp), AOX1 โปรโมเตอร์ (94 bp), และเทอร์มิเนเตอร์ transcription (99 bp)เซลล์ฟรีสื่อวัฒนธรรมจาก 24 h เกิดจากเมทานอลต้องใช้ recombinant ไมโครวัฒนธรรมพบว่ามีโปรตีน extracellular ต่อเซลล์ไปจนถึง$ 0.31 pg 1.87 เซลล์สำหรับ 24 recombinant stainstested เลือก pastoris P. KM71invGS ต้องใช้ผลการ extracellularproteinper cellthat extracellularprotein thanthe 6 foldhigher ต่อเซลล์ที่กำหนดสำหรับสายพันธุ์ผลิตต่ำได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.2 . การก่อสร้างของเย็นหน้า pastoris overproducer เมื่อย
ดีเอ็นเอของสายพันธุ์ puc57 ยืนยันถูกต้องลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน invgs . การเปรียบเทียบการสังเคราะห์ยีนมีความยาวเต็มรูปแบบของ 1175 BP . เราออกแบบดีเอ็นเอ sequencetoproduce ทีอา ไนเจอร์ gh1 เย็นเป็น amaturepolypeptide กรด 589amino . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่ใช้ aox1
ไพรเมอร์ ,แสดง 2 , 188 BP ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการยืนยัน ppic9invgs สร้างการแปลงของหน้า pastoris km71 กับสาลี่ ย่อย ppic9invgs พลาสให้ประมาณ 24 transformants ของเขา การวิเคราะห์ดีเอ็นเอจีโนมของแถบที่แยกได้จากหน้าpastoris km71invgs ( transformants ของเขา ) มี 1827 BP วงดนตรีที่สอดคล้องกับปัจจัย prepro อัลฟ่าหลั่งสัญญาณ ( 255 BP ) และอินเวอร์เทสสังเคราะห์ ( 0 bp ) นะครับ ลำดับ และชิ้นส่วนของหลาย ๆเว็บไซต์จากการ ppic9 เวกเตอร์ ( 15 คู่ ) , aox1 โปรโมเตอร์ ( 94 BP ) และถอดความ Terminator ( 99 BP ) .มือถือฟรีสื่อวัฒนธรรมจากเมทานอลและไมโครคอม 24 ชั่วโมงเมื่อยวัฒนธรรมแสดง Extracellular โปรตีนต่อเซลล์ตั้งแต่ 0.31 ถึง 1.87 pg / cell สำหรับ 24 รีคอมบิแนนท์ stainstested . เลือกหน้า pastoris km71invgs สายพันธุ์ให้ผลการ cellthat proteinper Extracellular
คือ 6-foldhigher สูงกว่า extracellularprotein ต่อเซลล์ได้โปรดิวเซอร์สุดเครียด