2.3. PCR amplification using differ

2.3. PCR amplification using different oligonucleotide primers
Amplification of DNA using primers SimP F and SimP R targeting
the mtDNA cyt b at 398 bp (Matsunaga et al., 1999) were performed
in a final volume of 50 ml containing 25 ml of DreamTaq PCR Master
Mix (2X) (Fermentas, Lithuania), 1 ml of 5 mM each primer (forward
and reverse for porcine DNA), NFWand 2 ml of approximately 50 ng
DNA template depending on the DNA concentration. A negative and
a positive DNA control was performed by adding 2 ml of NFW and
Pig Genomic DNA (Novagen®, Germany) respectively. The condition
of porcine DNA amplification assay consisting of the initial denaturation
at 95 C for 2 min, followed by 35 cycles of amplification at
94 C for 30 s (denaturation), hybridization at 55 C for 30 s, and
elongation at 72 C for 40 s, and a final extension step at 72 C for
3 min. It was carried out in the Mastercycler® gradient thermal
cycler (Eppendorf, USA). The amplification products were electrophoresed
through 2.5% (w/v) agarose gel in 1 X TAE buffer (40 mM
Tris-OH, 20 mM acetic acid and 1 mM of EDTA; pH 7.6) at 100 V for
45 min and stained in ethidium bromide.
The PCR amplification using primers pork 1 and pork 2 for COII
at 212 bp size (Lahiff et al., 2001) were performed in a final volume
of 50 ml containing 25 ml of DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Fermentas,
Lithuania) 1 ml of 100 mM each primers (forward and
reverse), NFW and 2 ml of approximately 50 ng DNA template. A
negative and a positive DNA control were performed as above.
Mastercycler® gradient thermal cycler (Eppendorf, USA) was used
to run the PCR with a temperature program consisting of the initial
denaturation at 95 C for 2 min, followed by 30 cycles of 94 C for
1 min, 55 C for 1 min, 72 C for 2 min, and a final extension step at

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. กระบือใช้ไพรเมอร์ oligonucleotide แตกต่างกันการขยายของดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์โดย F และ R โดยกำหนดเป้าหมายบีซีวายที mtDNA ที่ 398 bp (Matsunaga et al. 1999) ดำเนินการในปริมาณสุดท้ายของ 50 มล. 25 มล.ของ DreamTaq PCR Master ที่ประกอบด้วยส่วนผสม (2 X) (Fermentas ลิทัวเนีย), 1 มิลลิลิตร 5 มม.รองพื้น (ไปข้างหน้าและย้อนกลับสำหรับดีเอ็นเอหมู), NFWand 2 มิลลิลิตรประมาณ 50 ฉบับแม่แบบดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของดีเอ็นเอ ในแง่ลบ และทำตัวดีเอ็นเอควบคุมบวก โดยเพิ่ม 2 มล.ของ NFW และหมูออกดีเอ็นเอ (Novagen® เยอรมนี) ตามลำดับ เงื่อนไขการทดสอบขยายดีเอ็นเอหมูแปรสภาพเบื้องต้นประกอบด้วย95 c เป็นเวลา 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของขยายเวลาC 94 30 s (แปรสภาพ) hybridization 55 c เป็นเวลา 30 s และการยืดตัวที่ 72 C สำหรับ 40 s และขั้นตอนสุดท้ายนามสกุลที่ 72 C สำหรับ3 นาที จะดำเนินการในลาด Mastercycler® ความร้อนcycler (Eppendorf สหรัฐอเมริกา) ผลิตภัณฑ์ขยายได้ electrophoresedผ่านเจ agarose 2.5% (w/v) ใน 1 X TAE บัฟเฟอร์ (40 มม.ทริสเรทติ้ง OH กรดอะซิติก 20 มม. และ 1 มม.ของ EDTA ค่า pH 7.6) 100 V สำหรับ45 นาที และการย้อมสีในโบรไมด์ ethidiumขยาย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์หมู 1 หมู 2 สำหรับ COIIขนาด bp 212 (Lahiff et al. 2001) ที่ดำเนินการในโวลุ่มสุดท้ายของที่ประกอบด้วยปริมาตร 25 มิลลิลิตรผสมหลัก DreamTaq PCR (2 X) (Fermentas, 50 มล.ไพรเมอร์ลิทัวเนีย) 1 มล. 100 มม. (ไปข้างหน้า และกลับ), NFW และ 2 ml ประมาณ 50 ฉบับดีเอ็นเอแม่แบบ Aดีเอ็นเอควบคุมบวกและลบถูกดำเนินการดังกล่าวMastercycler® ใช้ไล่ระดับความร้อน cycler (Eppendorf สหรัฐอเมริกา)การเรียกใช้การ PCR กับโปรแกรมอุณหภูมิประกอบด้วยการเริ่มต้นแปรสภาพ 95 c เป็นเวลา 2 นาที ตาม ด้วย C 94 สำหรับ 30 รอบ1 นาที 55 C สำหรับ 1 นาที 72 C สำหรับ 2 นาที และนามสกุลสุดท้ายเป็นขั้นตอนที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 ขยาย PCR โดยใช้ oligonucleotide ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน
การขยายของดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ SIMP F และ SIMP R กำหนดเป้าหมาย
mtDNA CYT ขที่ 398 BP (Matsunaga et al., 1999) ได้ดำเนินการ
ในปริมาณสุดท้ายของ 50 มล. มี 25 มิลลิลิตร DreamTaq PCR โท
ผสม ( 2X) (Fermentas ลิทัวเนีย) 1 มิลลิลิตร 5 มิลลิแต่ละไพรเมอร์ (ไปข้างหน้า
และย้อนกลับดีเอ็นเอหมู) NFWand 2 มิลลิลิตรประมาณ 50 ng
แม่แบบดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของดีเอ็นเอ เชิงลบและ
ดีเอ็นเอบวกควบคุมได้ดำเนินการโดยการเพิ่ม 2 มิลลิลิตร NFW และ
หมู DNA ของยีน (Novagen®, เยอรมนี) ตามลำดับ สภาพ
ของสุกรทดสอบดีเอ็นเอประกอบด้วย denaturation เริ่มต้น
ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 35 รอบของการขยายที่
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที (denaturation) การผสมพันธุ์ที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ
การยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 วินาทีและเป็นขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72? C เป็นเวลา
3 นาที มันได้รับการดำเนินการในการระบายความร้อนMastercycler®ลาด
Cycler (Eppendorf, สหรัฐอเมริกา) ผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียงถูก electrophoresed
ผ่าน 2.5% (w / v) เจล agarose ใน 1 X TAE บัฟเฟอร์ (40 มิลลิเมตร
Tris-OH, 20 มิลลิเมตรกรดอะซิติกและ 1 มิลลิเมตร EDTA; ค่า pH 7.6) ที่ 100 V สำหรับ
45 นาทีและย้อมสีใน ethidium โบรไมด์.
ขยาย PCR โดยใช้ไพรเมอร์เนื้อหมูที่ 1 และหมู 2 COII
ที่ขนาด BP 212 (Lahiff et al., 2001) ได้ดำเนินการในเล่มสุดท้าย
50 มล. มี 25 มิลลิลิตร DreamTaq PCR โท Mix (2X) (Fermentas,
ลิทัวเนีย ) 1 มิลลิลิตร 100 มิลลิเมตรแต่ละไพรเมอร์ (ไปข้างหน้าและ
ย้อนกลับ) NFW และ 2 มิลลิลิตรประมาณ 50 ng แม่แบบดีเอ็นเอ
เชิงลบและเชิงบวกดีเอ็นเอควบคุมได้ดำเนินการดังกล่าวข้างต้น.
Mastercycler® Cycler ความร้อนลาด (Eppendorf, สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้
ในการเรียกใช้วิธี PCR กับโปรแกรมอุณหภูมิที่ประกอบด้วยแรก
denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 30 รอบของ 94? C เป็นเวลา
1 นาที 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและขั้นตอนการขยายสุดท้าย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 วิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ ( ซึ่งแตกต่างกันการเพิ่มปริมาณของดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ F และ R สภาพโอเค เป้าหมายที่แสดง cyt B ที่คุณ BP ( มัตสึ et al . , 1999 ) แสดงในเล่มสุดท้าย 50 ml บรรจุ 25 ml dreamtaq PCR มาสเตอร์ผสม ( 2x ) ( fermentas , ลิทัวเนีย ) 1 ml 5 มม. แต่ละ primer ( เดินหน้าและกลับสำหรับสุกร DNA ) , nfwand 2 ml ประมาณ 50 นาโนแม่แบบดีเอ็นเอขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของดีเอ็นเอ ลบและดีเอ็นเอที่ควบคุมได้ โดยบวกเพิ่ม nfw 2 มิลลิลิตร และหมู genomic DNA ( novagen ® , เยอรมนี ) ตามลำดับ เงื่อนไขการทดสอบดีเอ็นเอของสุกร ( ประกอบด้วย ( เริ่มต้น95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 35 รอบ แบบที่94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที ( ( ) , hybridization ที่ 55 C 30 s และความยาว 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 วินาที และสุดท้ายการก้าวที่ 72 C สำหรับ3 นาที มันก็ออกมาใน mastercycler ®ไล่ระดับความร้อนวงจร ( เพนดอร์ฟ , สหรัฐอเมริกา ) ผลิตภัณฑ์ ( electrophoresed คือผ่าน 2.5% ( w / v ) เจลใน 1 x แทบัฟเฟอร์ ( 40 มม.บริษัทโอ 20 มม. และ 1 mM กรด EDTA ; pH 7.6 ) ที่ 100 V สำหรับ45 นาที และเลอะทิเดียมโบรไมด์ .การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ โดยใช้ไพรเมอร์ 1 และ 2 สำหรับ coii หมูหมูขนาด 212 BP ( lahiff et al . , 2001 ) ได้ในเล่มสุดท้าย50 ml บรรจุ 25 ml dreamtaq PCR ( fermentas Master Mix ( 2x ) ,ลิทัวเนีย ) 1 ml 100 มม. แต่ละชนิด ( ไปข้างหน้าและย้อนกลับ ) , nfw 2 มิลลิลิตรประมาณ 50 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ เป็นลบและบวก DNA ควบคุมมีการปฏิบัติข้างต้นmastercycler ®ไล่ระดับความร้อนรอบ ( เพนดอร์ฟ , USA ) ถูกใช้การใช้ PCR ที่มีอุณหภูมิเริ่มต้นของโปรแกรมประกอบด้วย( 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 30 รอบ 94 C สำหรับ1 นาที , 55 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที และสุดท้ายการก้าวที่