2.3. Preparation of protein for liq

2.3. Preparation of protein for liquid-chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS)

Protein preparation was carried out using a method Ten mg of DSPC was resuspended in 50 μl of distilled water (dH2O), followed by denaturation with 250 μl of 8 M urea and dilution with 950 μl dH2O, prior to trichloroacetic acid (TCA) precipitation with 310 μl of 100% TCA, 1250 μl methanol and 625 μl chloroform. Samples were vortex-mixed and incubated (4 °C, 10 min) before centrifugation (4500g, 4 °C, 10 min). The top phase was removed before adding 1 ml methanol. The sample was vortex mixed before centrifugation (4500×g, 4 °C, 10 min), the supernatants were removed and the solid sample washed twice with 1 ml acetone, centrifuged at 10,000g, at 4 °C for 5 min, and dried under vacuum. Then, the sample was resuspended in 100 μl dH2O.



Two μg peptide samples were analysed in a randomised sequence by capillary HPLC–MS/MS, using 140-min gradients as described by Martin, Munagapati, Salvo-Chirnside, Kerr, and Le Bihan (2012), on an online system consisting of a micro-pump (1200 binary HPLC system, Agilent, UK), coupled to a hybrid LTQ-Orbitrap XL instrument (Thermo-Fisher, UK). HPLC quality acetonitrile (Fisher, UK) and water were used. Suprapure 98–100% formic acid and 99% purity sequencing grade trifluoroacetic acid were purchased from Merck

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. เตรียมโปรตีนควบคู่ของเหลว chromatography รเมท (LC – MS/MS)การเตรียมโปรตีนดำเนินการโดยใช้วิธีการแก้ไข resuspended DSPC สิบมิลลิกรัมใน 50 μl ของน้ำกลั่น (dH2O), ตาม ด้วยแปรสภาพด้วย μl 250 ยูเรีย 8 เมตรและเจือจาง ด้วย dH2O μl 950 ก่อนฝนกรด trichloroacetic (TCA) กับ 310 μl 100% TCA เมทานอ μl 1250 และ 625 μl คลอโรฟอร์ม ตัวอย่างถูกผสม vortex และรับการกก (4 ° C, 10 นาที) ก่อนที่จะหมุนเหวี่ยง (4500g, 4 ° C, 10 นาที) ขั้นตอนด้านบนถูกเอาออกก่อนที่จะเพิ่มเมทานอล 1 มิลลิลิตร ตัวอย่างวนผสมก่อนหมุนเหวี่ยง (4500 × g, 4 ° C, 10 นาที), supernatants ถูกเอาออก และตัวอย่างไม้ล้าง ด้วยอะซิโตน 1 ml สอง จากที่ 10, 000 กรัม ที่ 4 ° C 5 นาที และอบแห้งภายใต้สุญญากาศ แล้ว ตัวอย่างคือ resuspended ใน 100 μl dH2OΜ 2 ตัวอย่างเปปไทด์ถูกวิเคราะห์ในลำดับสุ่ม โดยฝอย HPLC – MS/MS ใช้ 140 นาทีไล่ระดับสีตามที่อธิบายไว้ โดยมาร์ติน Munagapati, Chirnside ซัลโว เคอร์ Le Bihan (2012), ในระบบออนไลน์ซึ่งประกอบด้วยไมโครปั๊ม (1200 ไบนารี HPLC ระบบ Agilent สหราชอาณาจักร), ควบคู่ไปกับเครื่องไฮบริด XL LTQ-Orbitrap (Fisher เทอร์โม UK) ใช้ HPLC acetonitrile คุณภาพ (Fisher สหราชอาณาจักร) และน้ำ Suprapure 98 – 100% กรดฟอร์มิกและกรด trifluoroacetic ลำดับของความบริสุทธิ์ 99% เกรดซื้อจากเมอร์ค

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 เตรียมความพร้อมของโปรตีนสำหรับมวลสารของเหลวโครมาตีคู่ (LC-MS / MS)

เตรียมโปรตีนได้ดำเนินการโดยใช้วิธีสิบมิลลิกรัม DSPC ถูก resuspended ใน 50 ไมโครลิตรของน้ำกลั่น (dH2O) ตามด้วยการสูญเสียสภาพธรรมชาติ 250 ไมโครลิตรของ 8 เมตร ยูเรียและเจือจางด้วย 950 ไมโครลิตร dH2O ก่อนที่จะมีกรดไตรคลอโร (TCA) เร่งรัด 310 ไมโครลิตรของแท้ 100% TCA, 1250 ไมโครลิตรเมทานอลและ 625 ไมโครลิตรคลอโรฟอร์ม กลุ่มตัวอย่างเป็นน้ำวนผสมและบ่ม (4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที) ก่อนที่จะหมุนเหวี่ยง (4500G, 4 ° C, 10 นาที) ขั้นตอนด้านบนจะถูกลบออกก่อนที่จะเพิ่ม 1 มิลลิลิตรเมทานอล กลุ่มตัวอย่างเป็นน้ำวนผสมก่อนที่จะหมุนเหวี่ยง (4500 ×กรัม 4 ° C, 10 นาที), supernatants ถูกถอดออกและกลุ่มตัวอย่างที่เป็นของแข็งล้างครั้งที่สองกับ 1 มิลลิลิตรอะซีโตนหมุนเหวี่ยงที่ 10,000g ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและแห้ง ภายใต้สูญญากาศ จากนั้นกลุ่มตัวอย่างถูก resuspended ใน 100 ไมโครลิตร dH2O.



สองตัวอย่างไมโครกรัมเปปไทด์ถูกนำมาวิเคราะห์ในลำดับที่สุ่มจากเส้นเลือดฝอย HPLC-MS / MS โดยใช้การไล่ระดับสี 140 นาทีตามที่อธิบายมาร์ติน Munagapati, Salvo-Chirnside เคอร์และ Le Bihan (2012) บนระบบออนไลน์ประกอบด้วยไมโครปั๊ม (1200 ระบบ HPLC ไบนารี Agilent สหราชอาณาจักร), คู่กับไฮบริด LTQ-XL Orbitrap เครื่องดนตรี (เทอร์โมฟิชเชอร์, สหราชอาณาจักร) HPLC คุณภาพ acetonitrile (ฟิชเชอร์, สหราชอาณาจักร) และน้ำถูกนำมาใช้ Suprapure 98-100% กรดและมีความบริสุทธิ์ 99% ลำดับเกรดกรด TRIFLUOROACETIC ที่ซื้อมาจากเมอร์ค

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การเตรียมโปรตีนสำหรับ liquid chromatography ตีคู่มวลสาร ( LC ) MS / MS )การเตรียมโปรตีนโดยใช้วิธี 10 มิลลิกรัม dspc คือ resuspended 50 μ L ของน้ำกลั่น ( dh2o ) ตามมาด้วย ( 250 μลิตร 8 M ยูเรียและระดับ 950 μผม dh2o ก่อนที่กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) ตกตะกอนด้วยμ 310 ลิตร 100 % TCA , 1250 μ l เมทานอลและ 625 μชั้นคลอโรฟอร์ม จำนวนวนผสมบ่ม ( 4 ° C , 10 นาที ) ก่อนปั่น ( 4500g 4 ° C , 10 นาที ) ขั้นตอนด้านบนจะถูกลบออกก่อนที่จะเพิ่ม 1 มิลลิลิตรเมธานอล ตัวอย่าง Vortex ผสมก่อนปั่น ( 4500 × g 4 ° C , 10 นาที ) , supernatants ถูกถอดออกและซักสองตัวอย่างของแข็ง 1 มิลลิลิตร อะซิโตน ระดับที่ 10000g ที่ 4 ° C เป็นเวลา 5 นาที และอบแห้งภายใต้สูญญากาศ แล้ว จำนวน resuspended 100 μผม dh2o .สองμ G เปปไทด์วิเคราะห์ในลำดับสุ่มสำหรับ MS / MS HPLC และใช้ 140 นาที ไล่ตามที่อธิบายไว้โดยมาร์ติน munagapati Salvo chirnside เคอร์ , , และ Le bihan ( 2012 ) ในระบบออนไลน์ ซึ่งประกอบด้วยปั้ม MICRO ( 1200 ระบบ HPLC ไบนารี Agilent , UK ) ควบคู่กับลูกผสม ltq orbitrap XL เครื่องดนตรี ( เทอร์โมฟิชเชอร์ , UK ) ไนคุณภาพสูง ( Fisher , UK ) และน้ำที่ใช้ suprapure 98 - 100 % กรดและ 99% เกรดความบริสุทธิ์ จัดลำดับกรดไตรฟลูออโรอะซิติกถูกซื้อจากเมอร์ค