Identification of HBV genotype and

Identification of HBV genotype and precore and
basal core promoter variants
Hepatitis B virus genotyping was initially determined
using line probe assay (INNO-LiPA HBV;
Innogenetics, Belgium). HBV genotype was confirmed
by sequence analysis of the HBV surface/polymerase
gene as previously described.18 Variants with substitutions
in the precore (PC) region and basal core promoter
(BCP) region were identified by sequencing
after PCR amplification, as described by Ayres
et al.18 The PC variant was defined by the presence of
the G1896A mutation and the BCP variant by the
A1762T/G1764A mutation.
Liver biopsy
Liver biopsy was performed on all patients and histopathological
assessment was carried out by an experienced
liver pathologist who was blinded to the clinical
data. Ultrasound-guided biopsy was performed using
a 16-gauge Menghini needle (Hepafix; B Braun
Melsungen, Melsungen, Germany) under local anaesthesia.
Tissue specimens were first prepared for histopathology
examination and the other portions of thebiopsy stored at 80C or in an RNA stabilization
solution at 20C (RNALater; Ambion, Austin,
Texas, USA) for analysis, including both cccDNA
and pgRNA quantification. Fibrosis stage was
assessed using the METAVIR scoring system.19,20
Intrahepatic total and cccDNA quantification
Determination of HBV cccDNA levels was carried out
by real-time PCR using a LightCycler 1.0 and
LightCycler version 3.5 software (Roche Diagnostics).
Reaction volumes (20 ml) consisted of 2 ml extracted
DNA, 5mM MgCl2, 0.5 mM primer mix and 0.2 mM
hybridization probes. Selective HBV cccDNA primers
consisted of two upstream primers (CCC1 50-
GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-30 and CCC3
50-GTCTGTGCCTTCTCATCTGC-30) and a downstream
primer (CCC2 50-GTCCATGCCCCAAA
GCCACC-30). FRET hybridization probes were 50-
GTTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT-FL-30 and
50-LCR640-AGGTGAAGCGAAGTGCACACGGWC
C-30. Total intrahepatic DNA was measured using primers
RC1 50-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-30 and
RC2 50-CAGCAGGATGAAGAGGAA-30 and FRET
probes 50- CACTCACCAACCTSYTGTCCTCCAAFL-
30 and 50 ¼LCR640-TGTCCTGGYTATCGCT
GGATGTGTCT-30. Quantification standards were
derived by dilution of a linearized plasmid (pHBV
EcoR1) containing a greater than full-length HBV
genome of genotype D. This standard has been previously
titrated against the WHO international HBV reference
standard to correlate quantification values.
Variation in the amounts of liver tissue was normalized
by quantifying b-globin in each sample with the Roche
DNA control kit. The relaxed circular HBV DNA was
calculated as total HBV DNA – cccDNA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รหัสของลักษณะทางพันธุกรรมด้วยขั้น precore และตัวแปรหลักโรคโปรโมเตอร์เริ่มกำหนด genotyping ไวรัสตับอักเสบบีใช้ทดสอบโพรบบรรทัด (ด้วยขั้น INNO-ลิInnogenetics ประเทศเบลเยียม) ลักษณะทางพันธุกรรมด้วยขั้นได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ลำดับด้วยขั้นพื้นผิว/พอลิเมอเรสยีนเป็นก่อนหน้านี้ described.18 ตัวแปรกับแทนในภูมิภาค precore (พีซี) และโปรโมเตอร์โรคหลักภูมิภาค (BCP) ได้ระบุลำดับหลังจากขยาย PCR ตามที่อธิบายไว้ โดยออร้อยเอ็ด al.18 PC ตัวแปรถูกกำหนดตามสถานะของการกลายพันธุ์ G1896A และตัวแปร BCP โดยA1762T/G1764A การกลายพันธุ์ตรวจชิ้นเนื้อตับตรวจชิ้นเนื้อตับถูกทำในผู้ป่วยทั้งหมด และ histopathologicalประเมินที่ดำเนินการ โดยการมีประสบการณ์การบำบัดการตับที่ถูกมองไม่เห็นไปที่คลินิกข้อมูล ทำตัวอัลตร้าซาวด์ตรวจชิ้นเนื้อโดยใช้เข็มมาตรวัด 16 Menghini (Hepafix B BraunMelsungen, Melsungen เยอรมนี) ภายใต้การระงับเนื้อเยื่อไว้เป็นตัวอย่างได้ก่อนเตรียมจุลพยาธิวิทยาตรวจสอบและบางส่วนของ thebiopsy ที่เก็บอยู่ ที่ 80 C หรือมีเสถียรภาพอาร์เอ็นเอ20 C (RNALater Ambion, Austinเท็กซัส สหรัฐอเมริกา) สำหรับวิเคราะห์ รวมทั้ง cccDNAและนับ pgRNA มี fibrosis ขั้นประเมินโดยใช้ METAVIR คะแนน system.19,20นับรวมและ cccDNA intrahepaticกำหนดระดับ cccDNA ด้วยขั้นดำเนินได้โดยใช้ LightCycler 1.0 PCR แบบเรียลไทม์ และLightCycler รุ่น 3.5 ซอฟต์แวร์ (Roche วินิจฉัย)ปฏิกิริยาปริมาณ (20 มล.) ประกอบด้วย 2 ml สกัดดีเอ็นเอ MgCl2 5 มม. 0.5 มม.รองพื้นผสม และ 0.2 mMคลิปปากตะเข้ hybridization ไพรเมอร์ใช้ด้วยขั้น cccDNAประกอบด้วยสองขั้นต้นน้ำไพรเมอร์ (CCC1 50-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC 30 และ CCC350-GTCTGTGCCTTCTCATCTGC-30) และปลายน้ำสีรองพื้น (CCC2 50-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-30) คลิปปากตะเข้ hybridization ไม่สบายใจได้ 50-GTTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT-FL-30 และ50-LCR640-AGGTGAAGCGAAGTGCACACGGWCC-30 ดีเอ็นเอ intrahepatic รวมถูกวัดโดยใช้ไพรเมอร์RC1 50-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-30 และRC2 50-CAGCAGGATGAAGAGGAA-30 และไม่สบายใจprobes 50 - CACTCACCAACCTSYTGTCCTCCAAFL -30 และ 50 ¼LCR640-TGTCCTGGYTATCGCTGGATGTGTCT-30 มาตรฐานนับได้ได้มา โดยการเจือจางของ plasmid linearized (pHBVประกอบด้วย EcoR1) ได้มากกว่าด้วยขั้นที่ปราศจากกลุ่มของลักษณะทางพันธุกรรมดี มาตรฐานนี้ได้รับก่อนหน้านี้titrated กับอ้างอิงต่างประเทศด้วยขั้นมาตรฐานการเชื่อมโยงนับค่าเปลี่ยนแปลงในจำนวนของเนื้อเยื่อตับได้ตามปกติโดย quantifying b globin ในแต่ละอย่างกับโรชชุดควบคุมดีเอ็นเอ เป็น DNA วงกลมด้วยขั้นที่ผ่อนคลายคำนวณเป็นผลรวมด้วยขั้น DNA – cccDNA

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บัตรประจำตัวของยีนไวรัสตับอักเสบบีและ precore และ
โปรโมเตอร์หลักฐานสายพันธุ์
ไวรัสตับอักเสบบี genotyping ไวรัสเป็นครั้งแรกที่กำหนด
โดยใช้การทดสอบวัดเส้น (INNO-Lipa ไวรัสตับอักเสบบี;
INNOGENETICS, เบลเยียม) genotype ไวรัสตับอักเสบบีได้รับการยืนยัน
โดยการวิเคราะห์ลำดับของพื้นผิวไวรัสตับอักเสบบี / โพลิเมอร์
ยีนเป็น described.18 ก่อนหน้านี้สายพันธุ์ที่มีการเปลี่ยนตัวผู้เล่น
ใน precore (PC) ภูมิภาคและโปรโมเตอร์หลักพื้นฐาน
(BCP) ภูมิภาคถูกระบุโดยลำดับ
หลังจากที่ขยาย PCR ตามที่อธิบายยส์
และ al.18 ตัวแปร PC ถูกกำหนดโดยการปรากฏตัวของ
การกลายพันธุ์ G1896A และตัวแปร BCP โดย
A1762T / การกลายพันธุ์ G1764A.
การตรวจชิ้นเนื้อตับ
เนื้อเยื่อตับได้ดำเนินการกับผู้ป่วยและทางจุลพยาธิวิทยา
ประเมินได้ดำเนินการโดยมีประสบการณ์
อายุรเวชตับที่เป็นคนตาบอดไป คลินิก
ข้อมูล เนื้อเยื่อลตร้าซาวด์แนะนำได้ดำเนินการโดยใช้
16 เข็มวัด Menghini (Hepafix; B Braun
. Melsungen, Melsungen, เยอรมนี) ภายใต้การฉีดยาชาเฉพาะ
ตัวอย่างเนื้อเยื่อได้จัดทำครั้งแรกสำหรับจุลพยาธิวิทยา
ตรวจสอบและส่วนอื่น ๆ ของ thebiopsy เก็บไว้ที่ 80 C หรือ? เสถียรภาพ RNA
? วิธีการแก้ปัญหาที่ 20 C (RNAlater; Ambion, ออสติน,
เท็กซัสประเทศสหรัฐอเมริกา) สำหรับการวิเคราะห์ทั้ง cccDNA
และปริมาณ pgRNA เวทีพังผืดถูก
ประเมินโดยใช้ METAVIR คะแนน system.19,20
Intrahepatic ทั้งหมดและ cccDNA ปริมาณ
การกำหนดระดับ cccDNA ไวรัสตับอักเสบบีได้ดำเนินการ
โดย real-time PCR โดยใช้ LightCycler 1.0 และ
LightCycler รุ่น 3.5 ซอฟแวร์ (Roche Diagnostics).
ปริมาณปฏิกิริยา (20 มิลลิลิตร ) ประกอบด้วย 2 มิลลิลิตรสกัด
ดีเอ็นเอ 5mm MgCl2 ผสมรองพื้น 0.5 มิลลิและ 0.2 มิลลิ
probes พันธุ์ ไพรเมอร์เลือกไวรัสตับอักเสบบี cccDNA
ประกอบด้วยสองไพรต้นน้ำ (ccc1 50
GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-30 และ CCC3
50 GTCTGTGCCTTCTCATCTGC-30) และล่อง
ไพร (CCC2 50 GTCCATGCCCCAAA
GCCACC-30) หงุดหงิด probes พันธุ์เป็น 50
GTTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT-FL-30 และ
50 LCR640 AGGTGAAGCGAAGTGCACACGGWC-
C-30 รวมดีเอ็นเอ intrahepatic ถูกวัดโดยใช้ไพรเมอร์
RC1 50 CTCGTGGTGGACTTCTCTC-30 และ
RC2 50 CAGCAGGATGAAGAGGAA-30 และหงุดหงิด
probes 50 CACTCACCAACCTSYTGTCCTCCAAFL-
30 และ 50 ¼LCR640-TGTCCTGGYTATCGCT
GGATGTGTCT-30 มาตรฐานปริมาณที่ได้
มาโดยการลดสัดส่วนของพลาสมิดเชิงเส้น (pHBV
EcoR1) ที่มีมากกว่าความยาวเต็มรูปแบบไวรัสตับอักเสบบี
จีโนมของจีโนไทป์ D. มาตรฐานนี้ได้รับก่อนหน้านี้
ปรับขนาดกับไวรัสตับอักเสบบีต่างประเทศที่อ้างอิง
มาตรฐานเพื่อเทียบเคียงค่าปริมาณ.
การเปลี่ยนแปลงในปริมาณของ เนื้อเยื่อตับปกติ
โดยปริมาณ B-globin ในแต่ละตัวอย่างกับโรช
ชุดควบคุมดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอไวรัสตับอักเสบบีผ่อนคลายวงกลมถูก
คำนวณเป็นดีเอ็นเอของไวรัสตับอักเสบบีรวม - cccDNA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การจำแนกพันธุกรรม การศึกษาและหลักการพื้นฐาน และการจำแนกสายพันธุ์

ไวรัสตับอักเสบบีได้เริ่มกำหนดเขตใช้วิธีสอบสวนบรรทัด ( Inno
Lipa HBV ;
อินโนเจเนติก , เบลเยียม ) การศึกษาทางพันธุกรรมยืนยัน
โดยการวิเคราะห์ลำดับของยีน เช่น การพบผิว /
described.18 ก่อนหน้านี้ในการจำแนกสายพันธุ์แทน

( PC ) ภูมิภาคและหลักการพื้นฐาน( BCP ) เขตที่ถูกระบุโดยลำดับ
หลังจาก PCR ( ตามที่อธิบายไว้โดย Ayres
และ al.18 พีซีตัวแปรถูกกำหนดโดยการแสดงตนของ
g1896a การกลายพันธุ์และ BCP ) ด้วย
a1762t / g1764a กลายพันธุ์ ตับตรวจชิ้นเนื้อตับ biopsy

มีการรักษาและการประเมินการศึกษา
ถูกทำโดย มีประสบการณ์
ตับพยาธิวิทยาที่ตาบอดกับข้อมูลทางคลินิก

แนะนำการใช้อัลตราซาวด์ตรวจชิ้นเนื้อ
16 วัด menghini เข็ม ( hepafix ; B Braun
เมลล์ซุนเก่นเมลล์ซุนเก่น , เยอรมนี ) ภายใต้การระงับความรู้สึกท้องถิ่น ตัวอย่างแรกคือเตรียมเนื้อเยื่อ

การเปลี่ยนแปลงและส่วนอื่น ๆของ thebiopsy เก็บไว้ที่  80  C หรือในระดับเสถียรภาพ
โซลูชั่นที่  20  C ( rnalater ambion , ออสติน , เท็กซัส ;
, USA ) สำหรับการวิเคราะห์ทั้ง cccdna
pgrna และปริมาณ . ขั้นตอนการใช้ metavir คะแนนประเมินอยู่

intrahepatic ทั้งหมดและระบบ 19,20 cccdna ปริมาณ
กำหนดระดับ cccdna การศึกษาดำเนินการโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ โดยใช้ lightcycler

lightcycler 1.0 รุ่น 3.5 ซอฟต์แวร์ ( โรชวินิจฉัย )
) ปฏิกิริยา ( 20 มล. ) มี 2 ml ชุดสกัดดีเอ็นเอ 5
, , 0.5 มม. และรองพื้นผสม 0.2 mm
hybridization probes . เลือกศูนย์ cccdna ไพรเมอร์
ประกอบด้วยสองต้นไพรเมอร์ ( ccc1 50 - gcggwctccccgtctgtgcc-30 ccc3

และ 50-gtctgtgccttctcatctgc-30 ) และไพรเมอร์ ( ccc2 50-gtccatgccccaaa ตามน้ำ

gccacc-30 ) ฉลุ hybridization probes เป็น 50 และ 50-lcr640-aggtgaagcgaagtgcacacggwc

-
gttcacggtggtctccatgcgacgt-fl-30 c-30 . รวม intrahepatic ดีเอ็นเอไพรเมอร์
วัดโดยใช้50-ctcgtggtggacttctctc-30 RC1 RC2 50-cagcaggatgaagaggaa-30 และกลัดกลุ้มและ

) 50 - cactcaccaacctsytgtcctccaafl -
30 และ 50 ¼ lcr640-tgtcctggytatcgct
ggatgtgtct-30 . มาตรฐานปริมาณถูก
ได้มาโดยเจือจางของพลาสมิด ( ช่วง phbv
ecor1 ) ที่มีมากกว่าเต็มตัว HBV
จีโนมของพันธุกรรมมาตรฐานนี้ได้รับก่อนหน้านี้
dตลอดเวลากับคนที่
อ้างอิงการศึกษามาตรฐานสากลสัมพันธ์ปริมาณค่า
การเปลี่ยนแปลงในปริมาณของตับเป็นปกติ โดยค่า
b-globin ในแต่ละตัวอย่าง กับ โรช
DNA ควบคุมชุด ผ่อนคลาย HBV DNA จะถูกคำนวณเป็นวงกลมรวม HBV DNA )
cccdna .