Assay of inhibition of LAP by antib

Assay of inhibition of LAP by antibodies.An in vitro inhibitory assay was developed to investigate the effect of antibodies induced in the vaccinated sheep on the LAP activity. Protein A affinity column-purified IgG preparations from infected and control animals were assayed as follows. A 100-μl volume of LAP (60 μg) was preincubated with 100 μl of purified IgG (50 μg) at 37°C for 1 h. A 100-μl volume of this reaction mixture was then added, in duplicate, to wells of polystyrene microplates preloaded with 100 μl of 0.1 M glycine buffer, pH 8.3. The plate was then incubated for 10 min at 37°C prior to the addition of 50 μl of 4 mM L-leucine p -nitroanilide (pNA) to each well. LAP incubated without purified IgG served as a control. The OD405 was determined at time zero and following a 2-h incubation at 37°C, and the amount (in nanomoles) of pNA released per minute per milligram of protein was estimated as previously described (19). Protein concentrations were determined by using a Micro-BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, Ill.) (22).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จากการทดสอบการยับยั้งการตักโดย antibodies.an ทดสอบในหลอดทดลองยับยั้งการพัฒนาเพื่อศึกษาผลของแอนติบอดีในการชักนำให้เกิดการฉีดวัคซีนแกะกับกิจกรรมตัก โปรตีนสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดคอลัมน์บริสุทธิ์เตรียม IgG จากสัตว์ที่ติดเชื้อและการควบคุมถูก assayed ดังนี้ ปริมาณ 100 ไมโครลิตรของตัก (60 ไมโครกรัม) ถูก preinc​​ubated กับ 100 ไมโครลิตรของบริสุทธิ์ IgG (50 ไมโครกรัม) ที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงปริมาณ 100 ไมโครลิตรของผสมปฏิกิริยานี้ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วในที่ซ้ำกันเพื่อหลุมของสไตรีน microplates โหลดไว้กับ 100 ไมโครลิตรของ 0.1 เมตร glycine buffer, 8.3 ph แผ่นถูกแล้วบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 ° C ก่อนที่จะมีการเพิ่มขึ้นจาก 50 ไมโครลิตรของ 4 มม. L-leucine p-nitroanilide (PNA) เพื่อกันแต่ละ ตักบ่มโดยไม่บริสุทธิ์ IgG ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมod405 ถูกกำหนดที่ศูนย์เวลาและต่อไปนี้ฟักตัว 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C และปริมาณ (ใน nanomoles) ของ PNA ออกต่อนาทีต่อมิลลิกรัมของโปรตีนเป็นที่คาดกันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19) ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้โปรตีนทดสอบไมโคร BCA ชุด (เพียร์ซ, ฟอร์ด, ป่วย.) (22)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิเคราะห์ของยับยั้งการตักโดยแอนตี้การทดสอบลิปกลอสไขในได้รับการพัฒนาการตรวจสอบผลของแอนตี้เกิดในแกะ vaccinated กิจกรรมตัก โปรตีน A ความสัมพันธ์บริสุทธิ์คอลัมน์ IgG เตรียมจากการติดเชื้อ และควบคุมสัตว์ได้ assayed ดัง ปริมาตร 100-μl ของตัก (60 μg) ที่ preincubated กับ μl ของ IgG บริสุทธิ์ 100 (50 μg) ที่ 37° C สำหรับ 1 h ปริมาตร 100-μl ส่วนผสมปฏิกิริยานี้ถูกเพิ่ม สำเนา ไปบ่อของ microplates ติดโฟมกับ μl 100 0.1 M glycine บัฟเฟอร์ ค่า pH 8.3 ด้วย แล้วจานที่ incubated สำหรับ 10 นาทีที่ 37° C ก่อนแห่ง 50 μl ของ 4 มม. L leucine p - nitroanilide (pNA) ให้ดีละ ตัก incubated ไม่ มี IgG บริสุทธิ์ที่ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม OD405 การกำหนดเวลาศูนย์ และหลังบ่ม 2 h ที่ 37° C และยอดเงิน (ใน nanomoles) ของ pNA ออกต่อนาทีต่อ milligram โปรตีนได้ประมาณอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนด โดยใช้ไมโคร-BCA โปรตีนวิเคราะห์ชุด (เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด Ill.) (22)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สอบของข้อห้ามของตักโดยเมื่อเส้นเลือด.สอบ inhibitory ใน Vitro ที่ได้รับการพัฒนามาเพื่อตรวจสอบผลของเมื่อเส้นเลือดทำให้เกิดในฝูงแกะที่ฉีดวัคซีนในการทำกิจกรรมตัก การเตรียมอาหารโปรตีนที่คอลัมน์ความสัมพันธ์ - บริสุทธิ์ igg จากสัตว์ที่ติดเชื้อและควบคุมได้เพียรพยายามโดยมีรายละเอียดดังนี้ ระดับเสียง 100 - μl ของตัก( 60 ไมโครกรัม)เป็น preincubated พร้อมด้วย 100 μl ของบริสุทธิ์ igg ( 50 ไมโครกรัม)ใน C 37 °สำหรับ 1 ชั่วโมงระดับเสียง 100 - μl ของการผสมผสานการตอบสนองนี้ถูกเพิ่มในรายการที่ซ้ำกันถึงบ่อ microplates โพลีสไตรีนที่โหลดไว้ล่วงหน้าพร้อมด้วย 100 μl 0.1 ม.ถั่วเหลืองบัฟเฟอร์ pH 8.3 แล้ว แผ่นความร้อนก็ incubated สำหรับ 10 นาทีที่ 37 ° C ก่อนที่จะทำการเพิ่มของ 50 μl ของ 4 มม. L - leucine P - nitroanilide ( pna )เพื่อเป็นอย่างดีแต่ละห้อง igg ตัก incubated บริสุทธิ์โดยไม่ต้องจัดให้บริการเป็นการควบคุมให้ที่ บ้าน 405 ตั้งใจไว้แล้วว่าในช่วงเวลาและต่อไปนี้ที่ 2 - h อบที่ 37 ° C ,และจำนวนเงิน(ใน nanomoles )ของ pna ออกมาต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนเป็นการประมาณการไว้ก่อนหน้านี้( 19 ). ความเข้มข้นโปรตีนมีกำหนดโดยการใช้ micro - / span >สอบโปรตีนชุด(แทง Rockford แจ้งด้วยปัญญาดังนี้)( 22 )