Materials and methods2.1. Organism

Materials and methods
2.1. Organism and growth conditions
Bacillus spp., potent protease (SBP-114) and lipase (RK-2) producers
were isolated from the soil by enrichment and selective
screening on skim milk agar plate and tributyrin agar plate
respectively. These strains were identified by MIDILABS (New York,
DE, USA) as Bacillus licheniformis and B. subtilus based on 500-bp
analysis and on the partial 16S rRNA gene alignment with the Gene
Bank database (ncbi, 2012) (). The organisms were cultivated at
37  1
C in a bacteriological incubator for 24 h and subsequently
maintained at 4


C in a B.O.D incubator (Yorko, Deluxe-10) by
routine transfers on nutrient agar slants at pH value of 7.0.

2.2. Enzyme production in a bioreactor
The enzymes used for dehairing (protease) and degreasing
(lipase) were produced and optimized in a 300 L stirred bioreactor
(Scigenics, India) with a working volume of 220 L, separately. The
modified base medium (pH-7) used for protease production contained
(gL
K
2
HPO
4
1
): wheat bran (2); soybean meal (15); KH
(3.0); Na
2
SO
4
(2.0); and MgSO
4
.7H
O (0.10). The medium
used for lipase production contained (g/L): sunflower oil (2);
glucose (2); peptone (15); NH
4
NO
3
2
2
(3.0); and MgSO
O
(0.8 mM) (pH 8). These media were sterilized separately in situ at
121
C for 20 min and inoculated with 2.0% of the seed inoculum
(nutrient broth) (OD


660nm
PO
y 0.600). Fermentation for protease
production was carried out at 37  1


4
4
(1.0);
.7H
C for 24 h and for lipase
2
30  1
C for 36 h. Rest of the parameters remained same for both
the enzyme production. The impeller speed was initially adjusted to
350 rpm and compressed sterile air was sparged into the medium at
constant rate of 0.6-


The dissolved oxygen was not allowed to
fall below a fixed set point of 40% by cascading in both the cases.
VVM.
Samples were withdrawn periodically at 2 h intervals and analysed
for protease and lipase production. The fermentation parameters,
such as temperature, pH, dissolved oxygen and airflow
were continuously monitored using microprocessor-controlled
probes. The fermentation broth was centrifuged at 8000 g for
20 min at 4
C to obtain cell free broth, containing lipase and
protease respectively. The cell pellet was discarded and the crude
enzyme was used for dehairing and degreasing experiments.


The crude protease and lipase rich broth were further concentrated
four times separately by ultrafiltration (using Spintrex) using
10 kDa MWCO membrane cartridge.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ2.1. สิ่งมีชีวิตและเจริญเติบโตออกซิเจนบาซิลลัส โปรติเอสมีศักยภาพ (SBP-114) และผลิตเอนไซม์ไลเปส (RK-2)แยกจากดิน โดยการเพิ่มคุณค่า และเลือกคัดกรองบนแผ่นวุ้นนมพร่องมันเนยและแผ่นวุ้น tributyrinตามลาดับ สายพันธุ์เหล่านี้ถูก identified โดย MIDILABS (นิวยอร์กเดอ สหรัฐอเมริกา) เป็นบาซิลลัส licheniformis และ B. subtilus อิง 500 bpวิเคราะห์และคล้องบางส่วน 16S rRNA ยีนมียีนฐานข้อมูลธนาคาร (ncbi, 2012) () สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกที่37 1C ในตู้อบที่แบคทีเรีย สำหรับ 24 ชั่วโมง และในเวลาต่อมา4
C ในตู้อบที่ B.O.D (Yorko, Deluxe-10) โดยโอนเป็นประจำบนอาหารวุ้นเอียงที่ค่า pH 7.02.2 การผลิตเอนไซม์ในถังปฏิกรณ์ชีวภาพแบบเอนไซม์ที่ใช้สำหรับ dehairing (น้ำย่อย) และไข(เอนไซม์ไลเปส) ผลิต และเพิ่มประสิทธิภาพในถังปฏิกรณ์ชีวภาพแบบ 300 L กวน(Scigenics อินเดีย) กับทำเสียงของ 220 L แยกต่างหาก การmodified ฐานกลาง (pH 7) ใช้สำหรับการผลิตโปรติเอสที่มีอยู่(gLK2HPO41): รำข้าวสาลี (2); กากถั่วเหลือง (15); KH(3.0); นา2ดังนั้น4(2.0); และ MgSO4.7HO (0.10) สื่อใช้สำหรับผลิตเอนไซม์ไลเปสที่มีอยู่ (กรัม/ลิตร): น้ำมัน sunflower (2);กลูโคส (2); peptone (15); NH4ไม่ใช่322(3.0); และ MgSOO(0.8 มม.) (pH 8) สื่อเหล่านี้ได้ผ่านการฆ่าเชื้อแยกต่างหากในแหล่งกำเนิดที่121C 20 นาที และ inoculated ร้อยละ 2.0 ของ inoculum เมล็ด(สารอาหารน้ำซุป) (OD
660nmPOy 0.600) หมักสำหรับโปรติเอสการผลิตดำเนินการ 37 1
44(1.0);.7HC สำหรับ 24 ชม และเอนไซม์ไลเปส230 1C สำหรับ 36 เหลือพารามิเตอร์อยู่เดียวกันสำหรับทั้งสองการผลิตเอนไซม์ ความเร็วใบพัดเริ่มปรับปรุงการ350 rpm และบีบอัดอากาศที่ผ่านการฆ่าเชื้อคือ sparged เป็นสื่อที่คงอัตรา 0.6-
ออกซิเจนละลายน้ำไม่ได้รับอนุญาตให้ลดลงต่ำกว่าจุดที่ตั้งใน fixed 40% โดยซ้อนในทั้งสองกรณีVVMถอนเป็นระยะ ๆ ในช่วงเวลา 2 ชม. และวิเคราะห์ตัวอย่างสำหรับการผลิตโปรติเอสและไลเปส พารามิเตอร์การหมักเช่นอุณหภูมิ pH ออกซิเจนละลาย และ airflowได้รับการดูแลโดยใช้ไมโครโปรเซสเซอร์ควบคุมรบ น้ำซุปหมักเป็นผลิตภัณฑ์ที่ 8000 กรัมสำหรับ20 นาทีที่ 4C รับเซลล์ซุปฟรี ที่ประกอบด้วยเอนไซม์ไลเปส และโปรติเอสตามลำดับ เม็ดเซลล์ถูกละทิ้ง และยังดิบเอนไซม์ถูกใช้สำหรับ dehairing และการทดลองไข
โปรติเอสที่ดิบและน้ำซุปที่อุดมไปด้วยเอนไซม์ไลเปสได้ต่อไปเข้มข้นครั้งที่สี่แยก โดยใช้ ultrafiltration (ใช้ Spintrex)10 kDa MWCO เยื่อตลับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
2.1 สิ่งมีชีวิตและการเจริญเติบโตเงื่อนไข
Bacillus spp. น้ำย่อยที่มีศักยภาพ (SBP-114) และเอนไซม์ไลเปส (RK-2) ผู้ผลิต
ที่แยกได้จากดินโดยการเพิ่มปริมาณและเลือก
คัดกรองบนแผ่นวุ้นนมพร่องมันเนยและ tributyrin จานเลี้ยงเชื้อ
ตามลำดับ สายพันธุ์เหล่านี้ถูกระบุ Fi ed โดย MIDILABS (New York,
DE, USA) เป็น licheniformis Bacillus และ B subtilus บนพื้นฐาน 500 bp
วิเคราะห์และในส่วนการจัดตำแหน่งของยีน 16S rRNA กับยีน
ฐานข้อมูลธนาคาร (NCBI 2012) () สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการปลูกฝังที่
37? 1
ซีในศูนย์บ่มเพาะแบคทีเรียเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและต่อมา
เก็บรักษาไว้ที่ 4
?
C ในที่ประชุมคณะกรรมการศูนย์บ่มเพาะ (Yorko, Deluxe-10) โดย
การโอนเงินเป็นประจำในอาหารเลี้ยงเชื้อ slants ที่ค่า pH 7.0.
? 2.2 การผลิตเอนไซม์ในระบบถังหมัก
เอนไซม์ที่ใช้ในการ dehairing (protease) และล้างไขมัน
(เอนไซม์ไลเปส) มีการผลิตและเพิ่มประสิทธิภาพใน 300 L หมักแบบกวน
(Scigenics อินเดีย) มีปริมาณการทำงานของ L 220 แยก
ฐาน Modi Fi เอ็ดกลาง (pH-7) ใช้สำหรับการผลิตเอนไซม์โปรติเอมี
(gL
K
2
HPO
4
1
): รำข้าวสาลี (2); กากถั่วเหลือง (15); KH
(3.0); Na
2
SO
4
(2.0); และ MgSO
4
.7H
O (0.10) สื่อที่
ใช้สำหรับการผลิตเอนไซม์ไลเปสที่มีอยู่ (g / L): ดวงอาทิตย์ FL Ower น้ำมัน (2);
กลูโคส (2); เปปโตน (15); NH
4
NO
3
2
2
(3.0); และ MgSO
O
(0.8 มิลลิเมตร) (pH? 8) สื่อเหล่านี้ได้ผ่านการฆ่าเชื้อที่แยกจากกันในแหล่งกำเนิดที่
121
องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีและเชื้อด้วย 2.0% ของเชื้อเมล็ด
(สารอาหารน้ำซุป) (OD
?
660nm
PO
Y 0.600) หมักน้ำย่อย
ผลิตได้ดำเนินการที่ 37? 1
?
4
4
(1.0);
.7H
เซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและเอนไซม์ไลเปส
ที่ 2
วันที่ 30? 1
องศาเซลเซียสเป็นเวลา 36 ชั่วโมง ส่วนที่เหลือของพารามิเตอร์ที่ยังคงเหมือนเดิมสำหรับทั้ง
การผลิตเอนไซม์ ความเร็วในการผลักดันการปรับขั้นต้น
350 รอบต่อนาทีและอัดอากาศผ่านการฆ่าเชื้อถูก sparged เข้ากลางที่
อัตราดอกเบี้ยคงที่ของ 0.6-
?
ออกซิเจนที่ละลายในน้ำไม่ได้รับอนุญาตที่จะ
ลดลงต่ำกว่า Fi คงจุด 40% ที่กำหนดโดยซ้อนในทั้งสองกรณี.
VVM
ตัวอย่างที่ถูกถอนออกเป็นระยะที่ 2 ช่วงเวลาชั่วโมงและวิเคราะห์
สำหรับโปรติเอสและเอนไซม์ไลเปสผลิต พารามิเตอร์หมัก
เช่นอุณหภูมิค่า pH, ปริมาณออกซิเจนละลายน้ำและอากาศ FL โอ๊ย
ถูกตรวจสอบอย่างต่อเนื่องโดยใช้ไมโครโปรเซสเซอร์ที่ควบคุม
ยานสำรวจ น้ำซุปหมักถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8000 กรัมสำหรับ
20 นาทีที่ 4
C เพื่อให้ได้น้ำซุปฟรีมือถือที่มีเอนไซม์ไลเปสและ
โปรติเอสตามลำดับ เม็ดเซลล์ถูกทิ้งและน้ำมันดิบ
เอนไซม์ที่ใช้สำหรับ dehairing และการทดลองล้างไขมัน.
?
โปรติเอสมันดิบและน้ำซุปที่อุดมไปด้วยเอนไซม์ไลเปสได้รับการเพิ่มเติมความเข้มข้น
ครั้งที่สี่แยกโดย ltration Fi พิเศษ (ใช้ Spintrex) โดยใช้
10 ตลับเมมเบรน kDa MWCO

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ2.1 . สิ่งมีชีวิตและเงื่อนไขการเจริญเติบโตBacillus spp . ที่มีศักยภาพ ( sbp-114 ) และเอนไซม์โปรติเอส ( rk-2 ) ผู้ผลิตที่แยกได้จากดินโดยการเลือกและการคัดกรองในหางจานวุ้นนมและ tributyrin วุ้นแผ่นตามลำดับ สายพันธุ์เหล่านี้ identi จึงเอ็ดโดย midilabs ( นิวยอร์กเดอ , USA ) และ Bacillus licheniformis subtilus 500 BP ตามพ.การวิเคราะห์ในส่วนเบส 16S rRNA ยีนสอดคล้องกับยีนฐานข้อมูลของธนาคาร ( ncbi 2012 ) ( ) สิ่งมีชีวิตปลูกที่37 1C ในศูนย์บ่มเพาะแบคทีเรีย 24 H และในภายหลังรักษา 4C ใน b.o.d ฟักไข่ ( yorko deluxe-10 , โดยโอนตามปกติบนอาหารเลี้ยงเชื้อสารอาหาร slants ที่ค่า pH 7.0 .2.2 . การผลิตเอนไซม์ในถังปฏิกรณ์ชีวภาพเอนไซม์ที่ใช้ใน dehairing ( เอส ) และล้างไขมัน( เอนไซม์ ) ถูกผลิตและเพิ่มประสิทธิภาพในถังปฏิกรณ์กวน 300 ล.( scigenics , อินเดีย ) กับปริมาณการทำงานของ 220 ลิตร แยกต่างหาก ที่โมไดจึงเอ็ดฐานปานกลาง ( ph-7 ) ใช้สำหรับการผลิตโปรตีนที่มีอยู่( GLเค2เจริญ4 .1) : รำข้าวสาลี ( 2 ) ; กากถั่วเหลือง ; ( 15 ) KH( 3.0 ) นา2ดังนั้น4 .( 2.0 ) ; และ MgSO4 .. 7HO ( 0.10 ) ปานกลางใช้สำหรับการผลิตไลเปสประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร ) : Sun น้ำมัน ower fl ( 2 )กลูโคส ( 2 ) ; เปปโตน ( 15 ) ; นเ4 .ไม่3 .22( 3.0 ) และแมกนีเซียมซัลเฟตโอ( 0.8 มิลลิเมตร ) ( pH 8 ) สื่อพวกนี้ฆ่าเชื้อในแหล่งกำเนิดที่แยกต่างหาก121C เป็นเวลา 20 นาทีและใส่กับ 2.0 % ของปริมาณเมล็ดพันธุ์( ซุปสารอาหาร ) ( ตัวอย่าง660nmโปY 0.600 ) หมักดอง โปรติเอสดำเนินการใน 37 1 การผลิต4 .4 .( 1.0 ). 7HC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และไลเปส230 1C เป็นเวลา 36 ชั่วโมงส่วนที่เหลือของพารามิเตอร์ยังคงอยู่เหมือนกันสำหรับทั้งสองการผลิตเอนไซม์ . ความเร็วในประเทศปรับ350 รอบต่อนาทีและอากาศอัดปลอดเชื้อได้ sparged ลงในสื่อที่อัตราคงที่ - 0.6ออกซิเจนละลายน้ำก็ไม่ได้อยู่ด้านล่างจึง xed จุดตั้ง 40% โดย cascading ในทั้งสองกรณีการให้ .ตัวอย่างที่ถูกถอนเป็นระยะ ๆในช่วงเวลา 2 ชั่วโมงและวิเคราะห์การผลิตเอนไซม์โปรติเอส . การหมักพารามิเตอร์เช่นอุณหภูมิ , pH , ปริมาณออกซิเจนที่ละลายในน้ำและอากาศfl โอ๊ยมีการตรวจสอบอย่างต่อเนื่องโดยใช้ไมโครโปรเซสเซอร์ควบคุมเครื่องมือตรวจสอบ ส่วนน้ำหมักอยู่ที่ระดับ 8 , 000 กรัมสำหรับ20 นาที 4C เพื่อให้ได้น้ำซุปฟรีเซลล์ ประกอบด้วยเอนไซม์และโปรตีน ตามลำดับ เซลล์เม็ด ถูกทอดทิ้ง และดิบเอนไซม์ที่ใช้ dehairing ล้างไขมันและการทดลองการสร้างเอนไซม์ไลเปสดิบและน้ำซุปเข้มข้น ได้รวยสี่ครั้งโดยแยกเป็นพิเศษ จึง ltration ( ใช้ spintrex ) โดยใช้10 กิโล mwco เยื่อตลับหมึก