One μl of DNA, or cDNA, was used as

One μl of DNA, or cDNA, was used as a template in the PCR reaction. Two regions of 16S rRNA were amplified: the V3 region with the 338f-GC/518r primers [30] and the V9 region with the Ec1392-GC/Ec1055 primers [31]. PCR template was denatured for 5 min at 94°C, the initial annealing temperature was 66°C and this was decreased 1°C every cycle for 10 cycles, finally 20 cycles were performed at 56°C. The extension for each cycle was carried out at 72°C for 3 min while the final extension was at 72°C for 30 min. PCR products obtained with the two couples of primers were applied to an 8% (wt/vol) polyacrylamide gel (acrylamide- bis acrylamide 37:5:1) with a denaturing gradient ranging from 25 to 55%. The gels were subjected to a voltage of 200 V for 4 h at 60°C, stained for 30 min in 1X TAE containing 1X SYBR gold (Life Technologies) and then analyzed under UV using UVI pro platinum 1.1 Gel Software (Eppendorf, Hamburg, Germany). Selected DGGE bands, specific of each dietary habit, were excised from the gel with sterile pipette tips and purified in water. One microliter of the eluted DNA was used for the re-amplification using the primers and the conditions described above, and the PCR products were checked by means of DGGE. The original PCR product was run on the gel as the control. Products that migrated as a single band and at the same position as the control were purified using a PCR Extract Mini Kit (5PRIME, Hilden, Germany), according to the manufacturer’s instructions. Sequencing was performed with a Deoxy terminator cycle sequencing kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems), using the 518r or EC1055 primers. Searches were performed in public data libraries (GenBank) with the Blast search program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) in order to determine the closest known relatives of the obtained partial 16S rRNA gene sequences

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Μl หนึ่งของดีเอ็นเอ หรือ cDNA ถูกใช้เป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR ภาคสองของ 16S rRNA ที่ขยาย: ภูมิภาค V3 กับไพรเมอร์ 338f-GC/518r [30] และภูมิภาค V9 กับไพรเมอร์ Ec1392-GC/Ec1055 [31] แม่แบบ PCR ถูก denatured ใน 5 นาทีที่ 94° C, 66° C อุณหภูมิหลอมเริ่มต้น และนี้ถูกลดลง 1° C ทุกรอบสำหรับรอบ 10 สุดท้าย ดำเนิน 20 รอบที่ 56 องศาเซลเซียส ส่วนขยายสำหรับแต่ละรอบได้ดำเนินออกที่ 72° C สำหรับ 3 นาทีขณะขยายสุดท้ายอยู่ที่ 72° C สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR 30 นาทีรับกับคู่ที่สองของไพรเมอร์ที่ใช้เจล polyacrylamide เป็น 8% (wt/vol) (bis อะคริลาไมด์อะคริลาไมด์ 37:5:1) ด้วยการไล่ระดับสี denaturing ตั้งแต่ 25 ถึง 55% เจภายใต้แรงดัน 200 V สำหรับ h 4 ที่ 60° C สีสำหรับ 30 นาทีใน 1 X เต้มี 1 X SYBR ทอง (ชีวิตเทคโนโลยี) และวิเคราะห์แล้ว ภายใต้ UV ใช้แพลทินัม pro UVI 1.1 ซอฟต์แวร์เจล (Eppendorf ฮัมบูร์ก เยอรมนี) วง DGGE เลือก เฉพาะของนิสัยแต่ละอาหาร excised จากเจลด้วยเคล็ดลับเปตต์กอซ และบริสุทธิ์ในน้ำ ไมโครลิตรหนึ่งของดีเอ็นเอ eluted ใช้สำหรับขยายใหม่ที่ใช้ไพรเมอร์ที่เงื่อนไขที่อธิบายไว้ข้างต้น และผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจสอบ โดย DGGE ผลิตภัณฑ์ PCR ดั้งเดิมถูกเรียกใช้บนเจเป็นตัวควบคุม ผลิตภัณฑ์ที่ย้าย เป็นวงเดียว และตำแหน่งเดียวกันเป็นตัวควบคุมที่ ไม่บริสุทธิ์โดยใช้ PCR แยกมินิชุด (5PRIME, Hilden เยอรมนี), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับที่ดำเนินการกับ Deoxy เทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับชุด (เพอร์เอลเมอใช้ Biosystems), ใช้ 518r หรือไพรเมอร์ EC1055 ค้นหาที่ได้ดำเนินการในข้อมูลสาธารณะไลบรารี (GenBank) ด้วยโปรแกรมค้นหาระเบิด (ส่วน http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) เพื่อกำหนดญาติรู้จักใกล้เคียงที่สุดของได้รับบางส่วน 16S rRNA ยีนลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หนึ่งไมโครลิตรของดีเอ็นเอหรือยีนถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR สองภูมิภาคของ 16S rRNA ถูกขยาย: ภูมิภาค V3 กับ 338f-GC / 518r ไพรเมอร์ [30] และในภูมิภาค V9 กับ Ec1392-GC / Ec1055 ไพรเมอร์ [31] แม่แบบ PCR ได้เอทิลแอลกอฮอล์เป็นเวลา 5 นาทีที่ 94 องศาเซลเซียสอุณหภูมิการหลอมแรกคือ 66 องศาเซลเซียสและนี้ลดลง 1 องศาเซลเซียสทุกรอบ 10 รอบสุดท้าย 20 รอบได้รับการดำเนินการที่ 56 ° C ส่วนขยายสำหรับแต่ละรอบได้ดำเนินการที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีในขณะที่การขยายสุดท้ายอยู่ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ได้กับสองคู่ของไพรเมอร์ที่ถูกนำไปใช้กับ 8% (น้ำหนัก / ปริมาตร) เจลอะคริเลต (acrylamide- ทวิริลาไมด์ 37: 5: 1) ที่มีการไล่ระดับสี denaturing ตั้งแต่ 25-55% เจลถูกยัดเยียดให้แรงดันไฟฟ้า 200 V 4 ชั่วโมงที่ 60 องศาเซลเซียสสีเป็นเวลา 30 นาทีใน 1X TAE ที่มีทองคำ 1X SYBR (เทคโนโลยีชีวิต) และวิเคราะห์แล้วภายใต้แสงยูวีที่ใช้ทองคำโปร UVI 1.1 เจลซอฟต์แวร์ (Eppendorf ฮัมบูร์ก เยอรมนี) เลือกวงดนตรีที่ DGGE เฉพาะของแต่ละนิสัยการบริโภคอาหารที่ถูกตัดจากเจลที่มีเคล็ดลับปิเปตและผ่านการฆ่าเชื้อในน้ำบริสุทธิ์ หนึ่งไมโครลิตรดีเอ็นเอชะที่ใช้สำหรับเรื่องการขยายการใช้ไพรเมอร์และเงื่อนไขที่กล่าวไว้ข้างต้นและผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกตรวจสอบโดยวิธีการของ DGGE ผลิตภัณฑ์ PCR เดิมทำงานบนเจลเป็นตัวควบคุม ผลิตภัณฑ์ที่อพยพมาเป็นวงเดียวและในตำแหน่งเดียวกับการควบคุมที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้สารสกัดจาก PCR ชุดมินิ (5PRIME, ฮิลเดน, เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับได้ดำเนินการกับวงจรเทอร์มิ Deoxy ชุดลำดับ (เพอร์กินเอลเมอ Applied Biosystems) โดยใช้ 518r หรือ EC1055 ไพรเมอร์ การค้นหาได้ดำเนินการในห้องสมุดข้อมูลสาธารณะ (GenBank) กับโปรแกรมค้นหาระเบิด (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) เพื่อตรวจสอบญาติที่ใกล้เคียงที่สุดที่รู้จักกันของบางส่วนที่ได้รับ 16S rRNA ลำดับยีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผมμหนึ่งของ DNA หรือ cDNA ถูกใช้เป็นแม่แบบในการตรวจปฏิกิริยา สองภูมิภาคของเบส 16S rRNA เป็นขยาย : V3 เขตกับ 338f GC / 518r ไพรเมอร์ [ 30 ] และภูมิภาค V9 กับ ec1392 GC / ec1055 ไพรเมอร์ [ 31 ] แม่แบบ PCR ถูกใช้เป็นเวลา 5 นาทีที่ 94 ° C เริ่มต้นอุณหภูมิการอบอ่อนเป็น 66 ° C และจำนวน 1 ° C ทุก ๆ รอบ 10 รอบในที่สุด 20 รอบแสดงที่ 56 องศา ส่วนขยายในแต่ละรอบได้ดำเนินการที่ 72 ° C เป็นเวลา 3 นาทีในขณะที่ส่วนขยายสุดท้ายอยู่ที่ 72 ° C เป็นเวลา 30 นาที โดยผลิตภัณฑ์ที่ได้รับกับสองคู่ของไพรเมอร์เพื่อใช้เป็น 8 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) สารอะคริลาไมด์เจล ( - บิสอะคริลาไมด์ 37:5:1 ) กับี่ไล่ระดับตั้งแต่ 25 ถึง 55 %เจลได้ภายใต้แรงดัน 200 V 4 H 60 ° C , ย้อม 30 นาที ใน 1 แทประกอบด้วย 1x SYBR ทอง ( ไลฟ์ เทคโนโลยี ) และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โปร uvi ภายใต้ยูวีเจลแพลทินัม 1.1 ซอฟต์แวร์ ( เพนดอร์ฟ , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี ) การทดลองที่เฉพาะเจาะจงของแต่ละวง นิสัยใยอาหาร , ถูกตัดจากเจลด้วยทิปเปตเป็นหมันและทำให้บริสุทธิ์น้ำหนึ่งไมโครลิตรของตัวอย่างดีเอ็นเอถูกใช้เพื่อขยายกำลังการใช้ไพรเมอร์และเงื่อนไขที่อธิบายไว้ข้างต้น และ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกตรวจสอบโดยวิธีการของการทดลอง . สินค้าจากเดิมที่เคยใช้เจลเป็นตัวควบคุม ผลิตภัณฑ์ที่ได้อพยพ เป็นวงเดียว และในตำแหน่งเดียวกันเช่นการควบคุมได้ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เทคนิคสกัด Mini Kit ( 5prime Hilden , เยอรมนี ) ,ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การกระทำกับ Terminator Kit ( วงจรการดีอ ซี เพอร์กินเอลเมอร์ Applied Biosystems ) โดยใช้ 518r หรือ ec1055 รองพื้น การค้นหาข้อมูลในห้องสมุดประชาชน ( 5% ) ด้วยโปรแกรมระเบิดค้นหา ( http://www.ncbi.nlm.nih .14 / ระเบิด / ) เพื่อตรวจสอบใกล้ญาติของลำดับเบส 16S rRNA ยีนได้บางส่วน