increase the concentration of the ไ

increase the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ (cf. Example 1 of the Example Section). Alternatively, it is, for example, also possible to use the solution in which the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม will be subjected to the freeze-
drying (i.e., the freezing solution or cryopreservation medium) as a starting/ stock solution to achieve an increasing in the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์. Using the final freezing solution'for this purpose has the advantage that no extra stock solution has to be prepared for the consecutive incubation steps. This approach simplifies the handling of the incubation steps when a ของผสม of ไครโอโพรเทกแทนต์s are used in the incubation steps, say, for example, a ของผสม of skim milk powder with กลีเซอรอล or a ของผสม of skim milk powder, กลีเซอรอล and a carbohydrate such as sucrose or trehalose. In such a case, the prepared freezing solution (say, for example, 5 % (w/v) skim milk and 1 % (v/v) กลีเซอรอล in water or an aqueous solution of 5 % (w/v) skim milk, 1 % (v/v) กลีเซอรอล and 10 % (w/v) of a carbohydrate such as sucrose or trehalose), is used to "serially dilute" in each incubation step the medium in which the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are stored. This "serial dilution" can, for example, be achieved as follows. Half the volume of the cell medium in which the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are present is removed from the respective vial, and the same volume of the freezing solution is added for the first incubation step. The เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are then incubated for the desired period of time and then again 50 % of the volume of the incubation ของผสม is removed and replaced by the same volume of freezing solution for the second incubation step. This procedure can be repeated as often as desired, thereby increasing the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ in


7




each incubation step. If wanted the last incubation step may be carried out in the freezing solution.
[0039] The term "การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง" which is also known as lyophilisation, lyophilization, or cryodesiccation, is used in its regular meaning as the cooling of a liquid sample, resulting in the conversion of freeze-able solution into ice, crystallization of crystallisable solutes and the formation of an amorphous matrix ซึ่งประกอบรวมด้วย non-crystallizing solutes associated with unfrozen ของผสม, followed by evaporation (sublimation) of water from amorphous matrix. In this process the evaporation (sublimation) of the frozen water in the material is usually carried out under reducing the surrounding pressure to allow the frozen water in the material to sublimate directly from the solid phase to the gas phase. การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง typically includes the steps of pretreatment, freezing, primary drying and secondary drying.
[0040] The pretreatment includes any method of treating the desired product, i.e. here เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, prior to freezing. The pretreatment may, for example, include washing the cells, formulation revision (i.e., addition of components to increase stability and/or improve processing), or decreasing the amount of a high vapor pressure solvent or increasing the surface area.
[0041] The freezing step includes any method that is suitable for freezing of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. On a small scale, for example, in a laboratory, freezing may be done by placing the material in a การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง flask and rotating the flask in a bath, also known as a shell freezer, which is cooled by, for example, mechanical refrigeration, by a ของผสม of dry ice with an alcohol such as methanol or ethanol, or by liquid nitrogen. It is of course also possible to use a commercially available freeze-dry apparatus such as Thermo Scientific® Modulyo Freeze-Dry System distributed by Thermo Fisher Scientific Inc. On a larger scale, freezing is generally using a commercial, temperature controlled การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง machine. When freezing the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, the freezing is generally carried out rapidly, in order to avoid the formation of ice crystals. Usually, the freezing temperatures are between —50 °C and —80 °C.
[0042] The next step is the primary drying. During the primary drying phase, the pressure is lowered (typically to the range of a few millibars), and sufficient heat is supplied to the material for the water to sublime. The amount of heat necessary can be calculated using the sublimating molecules' latent heat of sublimation. In this initial drying phase, about 95% of the water in the material is sublimated. This phase may be slow (can be several days in the industry), because, if too much heat is added, the material's structure could be altered.


8






[0043] Secondary drying can follow as the last step in การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. The secondary
drying phase aims to remove, if present, unfrozen water molecules, since the ice was removed in the primary drying phase. In this phase, the temperature is usually higher than in the primary drying phase, and can even be above 0 °C, to break any physico-chemical interactions that have formed between the water molecules and the frozen material. Usually the pressure is also lowered in this stage to encourage desorption (typically in the range of microbars, or fractions of a pascal). After the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง process is complete, the vacuum is usually broken with an inert gas, such as nitrogen, before the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ที่ผ่าน การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง are packaged and/or stored for the further use.
[0044] As evident from the above, the present method belongs to the "pretreatment" as understood by the person skilled in the art and can be used together with any known methodology of freezing and drying material such as free or เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม as described herein.
[0045] Accordingly, since the at least two consecutive incubation steps can be carried out with any suitable following การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง steps, the การประดิษฐ์ is also directed to a method of preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, โดยที่ this method ประกอบรวมด้วย at least two consecutive incubation steps, โดยที่ the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are incubated in each incubation step in an สารละลาย บ่ม containing ไครโอโพรเทกแทนต์ over a suitable period of time, โดยที่ the concentration of ไครโอโพรเทกแทนต์ in the สารละลาย บ่ม is increased with each subsequent incubation step. Thus, while in the following the การประดิษฐ์ will be explained in more detail with reference to a การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง method, it should be understood that all these embodiments equally relate to the method of preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง as defined here.
[0046] In the method of the การประดิษฐ์ any suitable number of the least two consecutive incubation steps can be carried as long as the number is sufficient to provide a desired effect on, for example, the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม after the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. In illustrative embodiments the method ประกอบรวมด้วย 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 incubation steps, โดยที่ in each incubation step the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ is increased. The incubation in each of the incubation steps can be carried out over any suitable amount of time, for example, a time that is found to be able to achieve a desired long-term stability of the capsules and/or the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. A suitable incubation time as well as a suitable the number of incubation steps can be determined empirically, for example, by assessing the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง followed by (after a certain time period) re-
hydrating of the cells (cf. the Example Section in this regard). In some embodiments the
9




incubation time is typically about several minutes to about several hours per incubation step (cf., also in this regard the Example Section in which bacterial cells were incubated in each incubation step for about 25 minutes). The incubation can be carried out either without agitation but also under agitation (such as, for instance, shaking or rolling) to improve the uptake of the ไครโอโพรเทกแทนต์ by the encapsulation material and the cells.
[0047] In some embodiments of the method of the การประดิษฐ์, the same ไครโอโพรเทกแทนต์ or a ของผสม of the same ไครโอโพรเทกแทนต์ is used in each incubation step. The ไครโอโพรเทกแทนต์ can be any compound that is able to provide protection during the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง against damage to the use encapsulation material or the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. Examples of suitable ไครโอโพรเทกแทนต์s include, but are not limited to, skim milk, กลีเซอรอล, ไดเมธิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), ฟอร์มาไมด์, a ของผสม of ฟอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ (มัทธิว 1 ตัวอย่างของส่วนตัวอย่าง) อีกวิธีหนึ่งคือ เป็น เช่น นอกจากนี้ยังสามารถใช้การแก้ปัญหาที่จะต้องเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มในการแช่แข็ง-drying (i.e., the freezing solution or cryopreservation medium) as a starting/ stock solution to achieve an increasing in the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์. Using the final freezing solution'for this purpose has the advantage that no extra stock solution has to be prepared for the consecutive incubation steps. This approach simplifies the handling of the incubation steps when a ของผสม of ไครโอโพรเทกแทนต์s are used in the incubation steps, say, for example, a ของผสม of skim milk powder with กลีเซอรอล or a ของผสม of skim milk powder, กลีเซอรอล and a carbohydrate such as sucrose or trehalose. In such a case, the prepared freezing solution (say, for example, 5 % (w/v) skim milk and 1 % (v/v) กลีเซอรอล in water or an aqueous solution of 5 % (w/v) skim milk, 1 % (v/v) กลีเซอรอล and 10 % (w/v) of a carbohydrate such as sucrose or trehalose), is used to "serially dilute" in each incubation step the medium in which the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are stored. This "serial dilution" can, for example, be achieved as follows. Half the volume of the cell medium in which the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are present is removed from the respective vial, and the same volume of the freezing solution is added for the first incubation step. The เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are then incubated for the desired period of time and then again 50 % of the volume of the incubation ของผสม is removed and replaced by the same volume of freezing solution for the second incubation step. This procedure can be repeated as often as desired, thereby increasing the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ in7 แต่ละขั้นตอนคณะทันตแพทยศาสตร์ ถ้าต้องการขั้นตอนการฟักตัวสุดท้ายอาจจะดำเนินในการแก้ปัญหาที่ตรึง[0039] คำว่า "การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง" ซึ่งเรียกว่า lyophilisation, lyophilization หรือ cryodesiccation ใช้ในความหมายทั่วไปเป็นการระบายความร้อนของของเหลวตัวอย่าง ในการแปลงของโซลูชันที่สามารถแช่แข็งเป็นน้ำแข็ง การตกผลึกของ crystallisable solutes และการก่อตัวของเมทริกซ์การไป ซึ่งประกอบรวมด้วยไม่ใช่ crystallizing solutes สัมพันธ์กับตรึงของผสม ตาม ด้วยการระเหย (ระเหิด) น้ำจากเมทริกซ์ไป ในกระบวนการนี้ (ระเหิด) การระเหยของน้ำแช่แข็งในวัสดุจะโดยปกติดำเนินภายใต้ดันโดยรอบเพื่อให้น้ำแข็งในวัสดุการ sublimate ระยะก๊าซโดยตรงจากเฟสของแข็ง การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งโดยทั่วไปประกอบด้วยขั้นตอนของ pretreatment แช่แข็ง หลักการอบแห้งและการอบแห้งรอง[0040] pretreatment จะมีวิธีใดรักษาต้องผลิตภัณฑ์ เช่นที่นี่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ก่อนแช่ การ pretreatment เช่น อาจ รวมล้างเซลล์ ปรับปรุงกำหนด (เช่น นอกจากนี้ส่วนประกอบเพื่อเพิ่มความมั่นคง และ/หรือปรับปรุงประมวลผล), หรือการลดจำนวนของตัวทำละลายความดันไอสูง หรือการเพิ่มพื้นที่ผิวได้[0041] The freezing step includes any method that is suitable for freezing of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. On a small scale, for example, in a laboratory, freezing may be done by placing the material in a การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง flask and rotating the flask in a bath, also known as a shell freezer, which is cooled by, for example, mechanical refrigeration, by a ของผสม of dry ice with an alcohol such as methanol or ethanol, or by liquid nitrogen. It is of course also possible to use a commercially available freeze-dry apparatus such as Thermo Scientific® Modulyo Freeze-Dry System distributed by Thermo Fisher Scientific Inc. On a larger scale, freezing is generally using a commercial, temperature controlled การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง machine. When freezing the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, the freezing is generally carried out rapidly, in order to avoid the formation of ice crystals. Usually, the freezing temperatures are between —50 °C and —80 °C.[0042] The next step is the primary drying. During the primary drying phase, the pressure is lowered (typically to the range of a few millibars), and sufficient heat is supplied to the material for the water to sublime. The amount of heat necessary can be calculated using the sublimating molecules' latent heat of sublimation. In this initial drying phase, about 95% of the water in the material is sublimated. This phase may be slow (can be several days in the industry), because, if too much heat is added, the material's structure could be altered.

8






[0043] Secondary drying can follow as the last step in การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. The secondary
drying phase aims to remove, if present, unfrozen water molecules, since the ice was removed in the primary drying phase. In this phase, the temperature is usually higher than in the primary drying phase, and can even be above 0 °C, to break any physico-chemical interactions that have formed between the water molecules and the frozen material. Usually the pressure is also lowered in this stage to encourage desorption (typically in the range of microbars, or fractions of a pascal). After the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง process is complete, the vacuum is usually broken with an inert gas, such as nitrogen, before the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ที่ผ่าน การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง are packaged and/or stored for the further use.
[0044] As evident from the above, the present method belongs to the "pretreatment" as understood by the person skilled in the art and can be used together with any known methodology of freezing and drying material such as free or เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม as described herein.
[0045] Accordingly, since the at least two consecutive incubation steps can be carried out with any suitable following การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง steps, the การประดิษฐ์ is also directed to a method of preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, โดยที่ this method ประกอบรวมด้วย at least two consecutive incubation steps, โดยที่ the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are incubated in each incubation step in an สารละลาย บ่ม containing ไครโอโพรเทกแทนต์ over a suitable period of time, โดยที่ the concentration of ไครโอโพรเทกแทนต์ in the สารละลาย บ่ม is increased with each subsequent incubation step. Thus, while in the following the การประดิษฐ์ will be explained in more detail with reference to a การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง method, it should be understood that all these embodiments equally relate to the method of preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง as defined here.
[0046] In the method of the การประดิษฐ์ any suitable number of the least two consecutive incubation steps can be carried as long as the number is sufficient to provide a desired effect on, for example, the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม after the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. In illustrative embodiments the method ประกอบรวมด้วย 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 incubation steps, โดยที่ in each incubation step the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ is increased. The incubation in each of the incubation steps can be carried out over any suitable amount of time, for example, a time that is found to be able to achieve a desired long-term stability of the capsules and/or the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. A suitable incubation time as well as a suitable the number of incubation steps can be determined empirically, for example, by assessing the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง followed by (after a certain time period) re-
hydrating of the cells (cf. the Example Section in this regard). In some embodiments the
9




incubation time is typically about several minutes to about several hours per incubation step (cf., also in this regard the Example Section in which bacterial cells were incubated in each incubation step for about 25 minutes). The incubation can be carried out either without agitation but also under agitation (such as, for instance, shaking or rolling) to improve the uptake of the ไครโอโพรเทกแทนต์ by the encapsulation material and the cells.
[0047] In some embodiments of the method of the การประดิษฐ์, the same ไครโอโพรเทกแทนต์ or a ของผสม of the same ไครโอโพรเทกแทนต์ is used in each incubation step. The ไครโอโพรเทกแทนต์ can be any compound that is able to provide protection during the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง against damage to the use encapsulation material or the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม. Examples of suitable ไครโอโพรเทกแทนต์s include, but are not limited to, skim milk, กลีเซอรอล, ไดเมธิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), ฟอร์มาไมด์, a ของผสม of ฟอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ (เทียบตัวอย่างที่ 1 ของมาตราตัวอย่าง) อีกทางเลือกหนึ่งที่มันเป็นเช่นนี้ยังเป็นไปได้ที่จะใช้วิธีการแก้ปัญหาในการที่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะได้รับภายใต้ freeze-
อบแห้ง (เช่นการแก้ปัญหาการแช่แข็งหรือขนาดกลางเก็บรักษา) ในขณะที่เริ่มต้น / หุ้นวิธีการแก้ปัญหาเพื่อให้บรรลุ เพิ่มขึ้นในความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ ใช้แช่แข็งสุดท้าย solution'for วัตถุประสงค์นี้มีประโยชน์ที่ไม่มีการแก้ปัญหาสต็อกเป็นพิเศษจะต้องมีการเตรียมไว้สำหรับขั้นตอนการบ่มติดต่อกัน วิธีการนี้จะช่วยลดความยุ่งยากในการจัดการขั้นตอนการบ่มเมื่อของผสมของไครโอโพรเทกแทนต์ s ที่ใช้ในขั้นตอนการบ่มพูดเช่นของผสมของหางนมผงที่มีกลีเซอรอลหรือ ของผสมของผงนมพร่องมันเนย, กลีเซอรอลและคาร์โบไฮเดรตเช่นซูโครสหรือทรีฮาโล ในกรณีเช่นนี้การแก้ปัญหาการแช่แข็งที่เตรียมไว้ (พูดยกตัวอย่างเช่น 5% (w / v) หางนมและ 1% (v / v) กลีเซอรอลในน้ำหรือสารละลาย 5% (w / v) หางนม, 1% (v / v) กลีเซอรอลและ 10% (w / v) ของคาร์โบไฮเดรตเช่นซูโครสหรือทรีฮาโล) จะใช้ในการ "ลำดับเจือจาง" ในแต่ละขั้นตอนการบ่มกลางซึ่งในเซลล์ที่ที่ ได้รับการห่อหุ้มจะถูกเก็บไว้ นี้ "เจือจางอนุกรม" สามารถยกตัวอย่างเช่นทำได้ดังต่อไปนี้ ครึ่งหนึ่งของปริมาณของกลางมือถือซึ่งเป็นเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มเป็นปัจจุบันออกจากขวดตามลำดับและปริมาณเดียวกันของการแก้ปัญหาการแช่แข็งจะถูกเพิ่มสำหรับขั้นตอนการบ่มแรก เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะบ่มแล้วในช่วงเวลาที่ต้องการของเวลาและหลังจากนั้นอีก 50% ของปริมาณการฟักตัวของผสมจะถูกลบออกไปและแทนที่ด้วยปริมาณเดียวกันของการแก้ปัญหาการแช่แข็งสำหรับขั้นตอนการบ่มที่สอง ขั้นตอนนี้สามารถทำซ้ำได้บ่อยตามที่ต้องการจึงช่วยเพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ใน7 แต่ละขั้นตอนการบ่ม หากต้องการขั้นตอนการบ่มที่ผ่านมาอาจจะดำเนินการในการแก้ปัญหาการแช่แข็ง. [0039] คำว่า "การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง" ซึ่งเป็นที่รู้จักกัน lyophilisation, lyophilization หรือ cryodesiccation ถูกนำมาใช้ในความหมายปกติในฐานะที่ระบายความร้อน ของกลุ่มตัวอย่างที่มีสภาพคล่องที่มีผลในการแปลงของการแก้ปัญหาการแช่แข็งสามารถลงไปในน้ำแข็งตกผลึกของสาร crystallisable และการก่อตัวของเมทริกซ์สัณฐานซึ่งประกอบรวมด้วยสารที่ไม่ตกผลึกที่เกี่ยวข้องกับ unfrozen ของผสมตามด้วยการระเหย (ระเหิด) น้ำ จากเมทริกซ์อสัณฐาน ในขั้นตอนนี้ระเหย (ระเหิด) ของน้ำแช่แข็งในวัสดุจะดำเนินการมักจะออกภายใต้การลดความดันโดยรอบเพื่อให้น้ำแช่แข็งในวัสดุที่จะระเหิดโดยตรงจากของแข็งเป็นระยะก๊าซ การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งมักจะมีขั้นตอนการปรับสภาพของการแช่แข็งแห้งอบแห้งหลักและรอง. [0040] ที่มีการปรับสภาพวิธีการรักษาที่ต้องการผลิตภัณฑ์ใด ๆ ที่นี่คือเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มก่อนที่จะแช่แข็ง การปรับสภาพอาจยกตัวอย่างเช่นรวมถึงการล้างเซลล์แก้ไขสูตร (เช่นการเพิ่มของชิ้นส่วนที่จะเพิ่มความมั่นคงและ / หรือปรับปรุงการประมวลผล) หรือลดปริมาณของความดันไอสูงตัวทำละลายหรือเพิ่มพื้นที่ผิว. [0041] ที่ แช่แข็งรวมถึงขั้นตอนวิธีการใด ๆ ที่เหมาะสำหรับการแช่แข็งของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ในระดับที่มีขนาดเล็กเช่นในห้องปฏิบัติการแช่แข็งอาจจะทำโดยการวางวัสดุในการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งขวดและหมุนขวดในห้องอาบน้ำที่เรียกว่าเป็นช่องแช่แข็งเปลือกหอยซึ่งเป็นที่ระบายความร้อนด้วย, ตัวอย่างเช่นเครื่องทำความเย็นทางกลโดยของผสมของน้ำแข็งแห้งที่มีเครื่องดื่มแอลกอฮอล์เช่นเมทานอลหรือเอทานอลหรือไนโตรเจนเหลว มันเป็นของหลักสูตรยังเป็นไปได้ที่จะใช้อุปกรณ์แช่แข็งแห้งใช้ได้ในเชิงพาณิชย์เช่นเทอร์โมScientific® Modulyo ระบบแช่แข็งแห้งจัดจำหน่ายโดยเทอร์โมฟิชเชอร์อิงค์วิทยาศาสตร์ในระดับขนาดใหญ่แช่แข็งโดยทั่วไปใช้ในเชิงพาณิชย์อุณหภูมิควบคุมการทำแห้งแบบ แช่เยือกแข็งเครื่อง เมื่อแช่แข็งเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มแช่แข็งจะดำเนินการโดยทั่วไปออกไปอย่างรวดเร็วในการสั่งซื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง โดยปกติอุณหภูมิแช่แข็งอยู่ระหว่าง -50 ° C ถึง -80 ° C. [0042] ขั้นตอนต่อไปคือการอบแห้งหลัก ในระหว่างขั้นตอนการอบแห้งหลัก, ความดันจะลดลง (โดยปกติในช่วงของมิลลิบาร์ไม่กี่) และความร้อนเพียงพอที่จะจ่ายให้กับวัสดุสำหรับน้ำที่ประเสริฐ ปริมาณความร้อนที่จำเป็นสามารถคำนวณโดยใช้โมเลกุล sublimating 'ความร้อนแฝงของการระเหิด ในขั้นตอนการอบแห้งครั้งแรกนี้ประมาณ 95% ของน้ำในวัสดุที่มีการระเหย ช่วงนี้อาจจะช้า (สามารถหลายวันในอุตสาหกรรม) เพราะถ้าร้อนมากเกินไปจะเพิ่มโครงสร้างของวัสดุที่อาจจะมีการเปลี่ยนแปลง. 8 [0043] อบแห้งรองสามารถทำตามเป็นขั้นตอนสุดท้ายในการทำแห้งแบบแช่เยือก แข็ง รองขั้นตอนการอบแห้งที่มีจุดมุ่งหมายที่จะลบถ้ามีโมเลกุลของน้ำ unfrozen เนื่องจากน้ำแข็งจะถูกลบออกในขั้นตอนการอบแห้งหลัก ในระยะนี้อุณหภูมิอยู่ที่มักจะสูงกว่าในขั้นตอนการอบแห้งหลักและยังสามารถจะสูงกว่า 0 องศาเซลเซียสจะทำลายใด ๆ ปฏิสัมพันธ์ทางกายภาพและทางเคมีที่ได้เกิดขึ้นระหว่างโมเลกุลของน้ำและวัสดุการแช่แข็ง โดยปกติความดันจะลดลงยังอยู่ในขั้นตอนนี้เพื่อส่งเสริมให้คาย (มักจะอยู่ในช่วงของไมโครหรือเศษของปาสคาลก) หลังจากที่มีการทำแห้งแบบแช่เยือกกระบวนการแข็งเสร็จสมบูรณ์สูญญากาศมักจะทำลายด้วยก๊าซเฉื่อยเช่นไนโตรเจนก่อนที่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มที่ผ่านการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งที่บรรจุและ / หรือ เก็บไว้ใช้งานต่อไป. [0044] ในขณะที่เห็นได้ชัดจากข้างต้นวิธีการในปัจจุบันเป็นของ "การปรับสภาพ" เป็นที่เข้าใจโดยคนที่มีฝีมือในงานศิลปะและสามารถใช้ร่วมกับวิธีการใด ๆ ของการแช่แข็งและวัสดุอบแห้งเช่นฟรี หรือเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มตามที่อธิบายไว้ในเอกสารฉบับนี้. [0045] ดังนั้นตั้งแต่อย่างน้อยสองขั้นตอนการบ่มติดต่อกันสามารถดำเนินการได้มีดังต่อไปนี้ที่เหมาะสมการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งขั้นตอนที่การประดิษฐ์เป็นผู้กำกับที่ยังเป็น วิธีการเตรียมเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มสำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, โดยที่วิธีการนี้ประกอบรวมด้วยอย่างน้อยสองขั้นตอนการบ่มติดต่อกันโดยที่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะบ่มในแต่ละขั้นตอนการบ่มใน สารละลายบ่มที่มีไครโอโพรเทกแทนต์ในช่วงระยะเวลาที่เหมาะสมของเวลาโดยที่ความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ในสารละลายบ่มจะเพิ่มขึ้นด้วยขั้นตอนการบ่มที่ตามมาแต่ละ ดังนั้นในขณะที่ต่อไปนี้การประดิษฐ์จะได้รับการอธิบายในรายละเอียดมากขึ้นด้วยการอ้างอิงถึงการทำแห้งแบบแช่เยือกวิธีการแข็งก็ควรจะเข้าใจว่า embodiments ทั้งหมดเหล่านี้อย่างเท่าเทียมกันที่เกี่ยวข้องกับวิธีการเตรียมเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม สำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งตามที่กำหนดไว้ที่นี่. [0046] ในวิธีการของการประดิษฐ์ใด ๆ จำนวนที่เหมาะสมอย่างน้อยสองขั้นตอนการบ่มติดต่อกันสามารถดำเนินการได้ตราบเท่าที่เลขหมายจะเพียงพอที่จะให้ผลที่ต้องการในสำหรับ ตัวอย่างเช่นการอยู่รอดและเติบโตได้ของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ใน embodiments ตัวอย่างวิธีการประกอบรวมด้วย 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 หรือ 10 ขั้นตอนการบ่มโดยที่ในแต่ละขั้นตอนการบ่มเพาะความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์จะเพิ่มขึ้น บ่มในแต่ละขั้นตอนการบ่มสามารถดำเนินการได้ในช่วงใด ๆ จำนวนที่เหมาะสมของเวลาเช่นเวลาที่พบว่ามีความสามารถที่จะประสบความสำเร็จที่ต้องการความมั่นคงในระยะยาวของแคปซูลและ / หรือการอยู่รอดและเติบโต ได้ของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม เวลาการบ่มที่เหมาะสมเช่นเดียวกับที่เหมาะสมจำนวนของขั้นตอนการบ่มสามารถระบุได้สังเกตุเช่นโดยการประเมินการอยู่รอดและเติบโตได้ของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งตามมาด้วย (หลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง) อีกครั้งผิวของเซลล์(เทียบมาตราตัวอย่างในเรื่องนี้) ในบาง embodiments 9 เวลาฟักตัวเป็นปกติเกี่ยวกับหลายนาทีหลายชั่วโมงต่อเกี่ยวกับขั้นตอนการบ่ม (cf ยังในเรื่องมาตราตัวอย่างนี้ที่เซลล์แบคทีเรียถูกบ่มในแต่ละขั้นตอนการบ่มเป็นเวลาประมาณ 25 นาที) ฟักตัวสามารถดำเนินการอย่างใดอย่างหนึ่งโดยไม่ต้องกวน แต่ยังอยู่ภายใต้การกวน (เช่นตัวอย่างเช่นการเขย่าหรือกลิ้ง) เพื่อปรับปรุงการดูดซึมของไครโอโพรเทกแทนต์โดยวัสดุที่ห่อหุ้มและเซลล์. [0047] ในบาง embodiments ของวิธีการที่ประดิษฐ์เดียวกันไครโอโพรเทกแทนต์หรือของผสมของเดียวกันไครโอโพรเทกแทนต์ที่ใช้ในแต่ละขั้นตอนการบ่ม ไครโอโพรเทกแทนต์สามารถเป็นสารประกอบที่สามารถให้การป้องกันในช่วงการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งต่อความเสียหายที่จะใช้วัสดุที่ห่อหุ้มหรือเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มใด ๆ ตัวอย่างของการที่เหมาะสมไครโอโพรเทกแทนต์ s รวมถึง แต่ไม่ จำกัด เฉพาะนมพร่องมันเนย, กลีเซอรอล, ไดเมธิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), ฟอร์มาไมด์เป็น ของผสมของฟอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ ( CF 1 ตัวอย่างของส่วนตัวอย่าง ) อีกวิธีหนึ่งคือ มันเป็น ตัวอย่าง นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะใช้โซลูชั่นที่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะต้องตรึง -
แห้ง ( เช่นโซลูชั่นหรือการเก็บรักษาแช่แข็งขนาดกลาง ) เป็นการเริ่มต้น / หุ้นโซลูชั่นการเพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ . การใช้สุดท้ายแจ่ม solution'for วัตถุประสงค์นี้มีความได้เปรียบที่ไม่รวมหุ้นโซลูชั่นที่ได้เตรียมไว้สำหรับขั้นตอนการบ่มติดต่อกันวิธีการนี้ช่วยจัดการ 4 ขั้นตอนเมื่อของผสมของไครโอโพรเทกแทนต์ S ใช้ใน 4 ขั้นตอน พูด ตัวอย่างเช่น ของผสมของหางนมผง กับกลีเซอรอลหรือของผสมของหางนมผงกลีเซอรอลและคาร์โบไฮเดรตเช่นซูโครสหรือการ . ในกรณีเช่นนี้ , เตรียมสารละลายแช่แข็ง ( พูดตัวอย่างเช่น 5% ( w / v ) หางนมผงและ 1% ( v / v ) กลีเซอรอลในน้ำหรือสารละลาย 5% ( w / v ) หางนม , 1% ( v / v ) และกลีเซอรอล 10% ( w / v ) ของคาร์โบไฮเดรต เช่น น้ำตาลซูโครส หรือ ทรีฮาโลส ) จะใช้ " เป็นเพียง " ในแต่ละขั้นตอนการบ่มขนาดกลางที่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มเก็บไว้ " ทากทะเล " สามารถ ตัวอย่างเช่นทำได้ดังนี้ ครึ่งหนึ่งของปริมาณของเซลล์ปานกลาง ซึ่งในเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มที่มีอยู่จะถูกเอาออกจากขวดนั้น และปริมาตรของสารละลายแช่แข็งเพิ่มขั้นตอนการบ่มเพาะก่อนการเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มแล้วบ่มเพื่อที่ต้องการ ระยะเวลา และอีก 50% ของปริมาณของการบ่มเพาะของผสมจะถูกลบออกและแทนที่ด้วยปริมาณเดียวกันของโซลูชั่นสำหรับขั้นตอนการบ่มแข็งสอง กระบวนการนี้สามารถทำซ้ำได้บ่อยเท่าที่ต้องการ จึงเพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ใน


7




แต่ละตามลำดับขั้นตอน ถ้าต้องการ 4 ขั้นตอนสุดท้ายอาจจะดำเนินการในการแช่สารละลาย .
[ ขอบคุณ ] คำว่า " การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง " ซึ่งเป็นที่รู้จักกันเป็น lyophilisation Tool , หรือ cryodesiccation ถูกใช้ในความหมายปกติของการระบายความร้อนของตัวอย่างของเหลวที่เกิดในการแปลงของแช่แข็งสามารถแก้ปัญหาลงในน้ำแข็งการตกผลึกของสารละลาย crystallisable และการก่อตัวของเมทริกซ์ซึ่งประกอบรวมด้วยสัณฐานไม่ตกผลึกสารละลายที่เกี่ยวข้องกับของผสม unfrozen ตามด้วยการระเหยของน้ำจากอสัณฐาน ( sublimation ) เมทริกซ์ในขั้นตอนนี้การระเหย ( sublimation ) ของแช่แข็งน้ำในวัสดุที่เป็นมักจะดำเนินการภายใต้การลดความดันโดยรอบเพื่อให้แช่แข็งน้ำในวัสดุเพื่อทำให้บริสุทธิ์โดยตรงจากเฟสของแข็งกับก๊าซระยะ การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งมักจะมีขั้นตอนของการประถมศึกษาและมัธยมศึกษา , แช่แข็งแห้ง , การอบแห้ง
.[ 0040 ] การรวมวิธีรักษาผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ คือ ที่นี่เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม ก่อนการแช่แข็ง ภาวะอาจจะยกตัวอย่างเช่น รวมล้างเซลล์ ทบทวนการกำหนด ( เช่น เพิ่มส่วนประกอบเพื่อเพิ่มเสถียรภาพและ / หรือปรับปรุงการประมวลผล )หรือลดปริมาณสูงความดันไอตัวทำละลายหรือเพิ่มพื้นที่ผิว .
[ ] 0041 แช่แข็งขั้นตอนรวมถึงการใด ๆวิธีที่เหมาะสำหรับการแช่แข็งของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม . ในระดับเล็ก ๆเช่นในห้องปฏิบัติการการแช่แข็งอาจจะทำโดยการวางวัสดุในการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งขวดและหมุนขวดในอ่าง หรือที่เรียกว่าเปลือกแข็งซึ่งเป็นแท่ง เช่น เครื่องจักรกล เครื่องทำความเย็น โดยของผสมของน้ำแข็งแห้งกับแอลกอฮอล์ เช่น เมทานอล หรือเอทานอล หรือไนโตรเจนเหลวมันเป็นหลักสูตรที่ยังเป็นไปได้ที่จะใช้แช่แข็งในเชิงพาณิชย์บริการอุปกรณ์เช่นเทอร์โมวิทยาศาสตร์® modulyo ตรึงแห้งระบบเทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ซึ่งจัดจำหน่ายโดยบนมาตราส่วนขนาดใหญ่ แข็ง โดยทั่วไปการใช้เชิงพาณิชย์ การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งควบคุมอุณหภูมิเครื่อง เมื่อเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มแช่แข็ง ,การแช่แข็งโดยทั่วไปดำเนินการอย่างรวดเร็วเพื่อหลีกเลี่ยงการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง โดยปกติ อุณหภูมิแช่แข็งอยู่ระหว่าง - 50 ° C และ - 80 องศา C .
[ 0042 ] ขั้นตอนต่อไปคือการทำแห้ง ในเบื้องต้นเฟสแห้ง ความดันจะลดลง ( โดยทั่วไป ในช่วงไม่กี่สี ) และความร้อนที่เพียงพอจะระบุให้วัสดุในน้ำสุดยอดมากปริมาณความร้อนที่จำเป็นสามารถคำนวณโดยใช้ sublimating โมเลกุล ' ความร้อนแฝงของการระเหิด . ในเบื้องต้นขั้นตอนการอบแห้ง ประมาณ 95 % ของน้ำในวัสดุที่เป็น sublimated . ขั้นตอนนี้อาจช้า ( อาจจะหลายวันในอุตสาหกรรม ) เพราะถ้าความร้อนมากเกินไปจะเพิ่มโครงสร้างของวัสดุที่สามารถเปลี่ยนแปลงได้


8