The measurement of C-triol concentr

The measurement of C-triol concentrations in plasma seems to
be particularly suited for NPC diagnosis. However, analytical
procedures for C-triol determinations have been addressed
specifically only in few studies. Jiang et al. and Boenzi et al.
[13,14] described LC–MS/MS assays for oxysterol quantification
after derivatization with N,N-dimethylgylcine or dimethylaminobutyrate,
respectively. Both methods – though robust and with
excellent analytical characteristics – require complex and expensive
equipment and high competence level by the operator, and
their availability is therefore limited to few reference centers.
Dzelatovic et al. [9] described a simple GC–MS-based method for
determination of C-triol along with other oxysterols in plasma
using derivatization with trimethylchlorosilane. However, these
authors have not performed adequate analytical validation and, in
addition, their method has not been tested for the capacity to
detect NPC patients. Similarly, the GC–MS method described by
Porter et al. [4] has not been characterized with respect to its
analytical performance. In the present study, we describe a simple
and reliable GC–MS method for the analysis of C-triol in plasma,
which has been specifically developed to improve NPC diagnosis.
Compared to Dzelatovic et al., we were able to improve
significantly the limit of detection of the method, which is similar
to those reported by Klinke et al., Jiang et al. and Boenzi et al. for
LC–MS/MS-based approaches. Our method permits reliable C-triol
determination in the concentration range covering endogenous
levels of this analyte in human plasma. In addition, it is
characterized by the precision and recovery, which are comparable
to LC–MS/MS-based procedures. Finally, we were able to reduce
sample consumption to only 0.1 mL per determination. This is a
positive improvement especially, when measurements are
expected to be performed mainly in pediatric patients with
limited availability of sample material.
Artefact formation during pre-analytical phase and sample
work-up is a major problem in the analysis of oxysterols, because
these compounds can be formed by the reaction of cholesterol with
oxygen in the ambient air or by non-enzymatic oxidation catalyzed
by poorly defined components of the matrix. Accordingly, strict
maintenance of cooling chain during the transportation, sample
storage at very low temperature and/or under argon atmosphere,
use of cold saponification, and the extensive application of
concentrated antioxidants such as butylated hydroxytoluene were
repeatedly recommended in most protocols for oxysterol measurement
[11]. However, testing of storage condition in this study
revealed little changes in C-triol concentrations in whole-blood
samples that were kept either for 72 h in the ambient temperature
or refrigerated for 1 week. In addition, we did not observe the
artificial formation of C-triol during the analysis even though in
our protocol cholesterol was not removed from the oxysterol
fraction. We surmise that the risk of autoxidation in the present
method is minimized by the fast and simple sample preparation
and in particular by the use of well-balanced volumes in small airtight
autosampler vials with less headspace and contact to air
oxygen during the saponification, extraction and derivatization
steps. In addition, due to the use of an efficient catalyzing agent
(NMIM) the silylation time was very short (10 min at 80 C). Finally,
we have forgone the removal of the silylation reagent, which likely
helps to prevent the desilylation of cholesterol after the sample
preparation and the subsequent autoxidation. Hence, in major
contrast to oxysterols such 7-KC, which was previously suggested
as a diagnostic marker for NPC, C-triol neither seems to be
generated by unspecific autoxidation of cholesterol during sample
storage or analytical procedurenor to undergo non-enzymatic
degradation. For this reason, C-triol should be considered the
preferred biomarker for NPC diagnosis, whereas 7-KC might be
used as an indicator of proper sample storage conditions. For
practical purposes, we recommend the sample storage at
20 C
for short time periods (up to 2 months), whereas for long-term
storage (up to 1 year) samples should be kept at
80 C. The
postage of blood samples without cooling is possible within 72 h.
In concordance with previously published results, our study
revealed increased levels of C-triol in subjects, in which NPC
diagnosis has been made by biochemical methods and confirmed
by DNA sequencing. The excellent capacity of C-triol to discriminate
between NPC patients and healthy individuals was further
confirmed using ROC analysis. The plasma C-triol concentration in
subjects affected from NPC was elevated byapproximately 8.1 folds,
which is in good agreement with the data obtained with LC–MS/
MS-based procedures published by Jiang et al. and Boenzi et al.
[12

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดูเหมือนว่าการประเมินของ C triol ความเข้มข้นในพลาสมาเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการวินิจฉัย NPC ได้ อย่างไรก็ตาม วิเคราะห์มีการระบุขั้นตอนการวิเคราะห์ปริมาณ C-triolโดยเฉพาะในศึกษาน้อย Jiang et al.และ Boenzi et al[13,14] อธิบาย LC – MS/MS assays สำหรับนับ oxysterolหลังจาก derivatization มี N, N-dimethylgylcine หรือ dimethylaminobutyrateตามลาดับ ทั้งสองวิธี – แข็งแกร่ง และมีลักษณะวิเคราะห์ที่ยอดเยี่ยม – ต้องซับซ้อน และราคาแพงอุปกรณ์และระดับความสามารถสูง โดยการดำเนินการ และความพร้อมใช้งานจึงจำกัดไม่กี่ศูนย์อ้างอิงวิธี GC – MS ใช้ง่ายสำหรับอธิบาย Dzelatovic et al. [9]กำหนด C triol พร้อมกับ oxysterols อื่น ๆ ในพลาสมาใช้ derivatization กับ trimethylchlorosilane อย่างไรก็ตาม เหล่านี้ผู้เขียนได้ทำการตรวจสอบวิเคราะห์อย่างเพียงพอ และ ในนอกจากนี้ วิธีการพวกเขาไม่ได้ทดสอบความสามารถในการตรวจพบผู้ป่วย NPC ในทำนองเดียวกัน วิธี GC – MS โดยไม่ได้โดดเด่นยกกระเป๋า et al. [4] การวิเคราะห์ประสิทธิภาพการทำงาน ในการศึกษาปัจจุบัน เราอธิบายแบบง่าย ๆและวิธี GC – MS ที่เชื่อถือได้สำหรับการวิเคราะห์ของ C triol ในพลาสมาซึ่งได้ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อปรับปรุงการวินิจฉัย NPC นั้นเมื่อเทียบกับ Dzelatovic et al. เราได้มีการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญถึงขีดจำกัดของการตรวจจับของวิธีการ ซึ่งคล้ายที่รายงาน โดย Klinke et al. Jiang et al. และ Boenzi et al.สำหรับLC – MS/MS ตามวิธี วิธีของเราอนุญาตให้เชื่อถือได้ C-triolกำหนดในช่วงความเข้มข้นที่ครอบคลุมภายนอกระดับของ analyte นี้ในพลาสมาของมนุษย์ นอกจากนี้ มันเป็นโดดเด่น ด้วยความแม่นยำและการกู้คืน ซึ่งจะเปรียบเทียบได้การ LC – MS/MS ตามขั้นตอน ในที่สุด เราก็สามารถที่จะลดตัวอย่างปริมาณการใช้ไปเพียง 0.1 mL ต่อความมุ่งมั่น นี้เป็นการปรับปรุงค่าบวก โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อวัดมีคาดว่าจะดำเนินการส่วนใหญ่ในผู้ป่วยเด็กด้วยจำกัดของวัสดุตัวอย่างก่อตัวเพี้ยนในระหว่างขั้นตอนการวิเคราะห์ล่วงหน้าและตัวอย่างแต่งงานที่เป็นปัญหาสำคัญในการวิเคราะห์ของ oxysterols เนื่องจากสารเหล่านี้สามารถเกิดขึ้น โดยปฏิกิริยาของไขมันด้วยออกซิเจน ในอากาศแวดล้อม หรือ โดยกระบวนการเกิดออกซิเดชันเอนไซม์ไม่ดีโดยกำหนดคอมโพเนนต์ของเมทริกซ์ ตามลำดับ เข้มงวดการบำรุงรักษาความเย็นโซ่ในระหว่างการขนส่ง ตัวอย่างเก็บ ที่อุณหภูมิต่ำมาก หรือภาย ใต้ บรรยากาศอาร์กอนใช้สะเย็น และการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางมีสารต้านอนุมูลอิสระเข้มข้นเช่น butylated hydroxytolueneแนะนำซ้ำ ๆ ในส่วนใหญ่โปรโตคอลสำหรับการวัด oxysterol[11] . อย่างไรก็ตาม การทดสอบการเก็บในสภาวะในการศึกษานี้เปิดเผยการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในความเข้มข้น C triol ในเม็ดเลือดตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้อย่างใดอย่างหนึ่งสำหรับ 72 ชั่วโมงในอุณหภูมิหรือตู้เย็นนาน 1 สัปดาห์ นอกจากนี้ เราไม่ได้สังเกตการก่อประดิษฐ์ของ C triol ในระหว่างการวิเคราะห์แม้ว่าในคอเลสเตอรโพรโทคอลของเราไม่ถูกเอาออกจากการ oxysterolเศษส่วน เราคาดการณ์ที่ความเสี่ยงของ autoxidation ในปัจจุบันวิธีที่จะลดลง โดยการเตรียมตัวอย่างง่าย และรวดเร็วและโดยเฉพาะอย่างยิ่งโดยการใช้สมดุลปริมาณขนาดเล็กของสุญญากาศเกิด vials เหมือนและสัมผัสกับอากาศน้อยลงออกซิเจนระหว่างสะ สกัด และ derivatizationขั้นตอนนี้ นอกจากนี้ เนื่องจากการใช้ตัวแทน catalyzing ที่มีประสิทธิภาพ(NMIM) silylation มากสั้นมาก (10 นาทีที่ 80 C) ในที่สุดเรามี forgone กำจัดสารเคมี silylation ซึ่งมีแนวโน้มช่วยป้องกันไม่ให้ desilylation ของคอเลสเตอรหลังจากตัวอย่างการเตรียมและ autoxidation ในเวลาต่อมา ด้วยเหตุนี้ ในหลักคมชัด oxysterols เช่น 7-KC ซึ่งก่อนหน้านี้มีการแนะนำเครื่องหมายวินิจฉัยสำหรับ NPC, C triol ไม่น่าจะเป็นสร้าง โดย unspecific autoxidation อลที่ระหว่างตัวอย่างเก็บข้อมูลหรือวิเคราะห์ procedurenor เจอไม่ใช่เอนไซม์ย่อยสลาย ด้วยเหตุนี้ C-triol ควรพิจารณาการต้องไบโอมาร์คเกอร์สำหรับ NPC การวินิจฉัย ในขณะที่ 7 KC อาจจะใช้เป็นตัวบ่งชี้สภาพการจัดเก็บอย่างเหมาะสม สำหรับปฏิบัติการเอนกประสงค์ เราขอแนะนำการเก็บตัวอย่างที่ 20 Cสำหรับรอบระยะเวลาสั้น (2 เดือน), ในขณะที่สำหรับระยะยาวตัวอย่างการเก็บข้อมูล (1 ปี) ควรเก็บไว้ที่ 80 cค่าไปรษณีย์ตัวอย่างเลือดโดยไม่ต้องระบายความร้อนเป็นไปได้ภายใน 72 ชมสอดคล้องกับที่ก่อนหน้านี้ประกาศผล การศึกษาของเราเพิ่มขึ้นของระดับ C triol ในวิชา ใน NPC ที่เปิดเผยวินิจฉัยได้โดยวิธีทางชีวเคมี และยืนยันโดยลำดับดีเอ็นเอ กำลังการผลิตที่ยอดเยี่ยมของ C triol การแยกแยะระหว่าง NPC ผู้ป่วยและบุคคลที่มีสุขภาพแก้ไขเพิ่มเติมยืนยันใช้ ROC วิเคราะห์ ความเข้มข้นในพลาสม่า C-triolวิชาที่ได้รับผลกระทบจาก NPC แก้ไขยกระดับ byapproximately 8.1 เท่าซึ่งอยู่ในข้อตกลงที่ดีกับข้อมูลที่ได้รับจาก LC – MS /MS ตามขั้นตอนโดย Jiang et al.และ Boenzi et al[12

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวัดความเข้มข้นในพลาสมาของ c-triol ดูเหมือนเป็นเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการวินิจฉัยดังกล่าว อย่างไรก็ตาม วิเคราะห์สำหรับขั้นตอนการ c-triol determinations ได้รับการ addressedโดยเฉพาะในไม่กี่วิชา เจียง et al . และ boenzi et al .[ 13,14 ] LC MS / MS สามารถอธิบายและ oxysterol ปริมาณสำหรับหลังจากกับกับ n-dimethylgylcine dimethylaminobutyrate , หรือ ,ตามลำดับ ทั้งสองวิธี - แม้ว่าเสถียรภาพ และกับยอดเยี่ยม คุณลักษณะที่ซับซ้อนและราคาแพง และต้องวิเคราะห์อุปกรณ์และระดับความสามารถสูง โดยผู้ประกอบการ และห้องพักของพวกเขาจึง จำกัด ศูนย์อ้างอิงบางdzelatovic et al . [ 9 ] อธิบายวิ GC –วิธีการที่ใช้สำหรับ MSการกำหนด c-triol พร้อมกับ oxysterols อื่นในพลาสมาใช้กับกับ trimethylchlorosilane . อย่างไรก็ตาม , เหล่านี้ผู้เขียนได้ทำการตรวจสอบวิเคราะห์อย่างเพียงพอและนอกจากนี้ วิธีการของพวกเขายังไม่ได้รับการทดสอบความสามารถพบผู้ป่วยดังกล่าว ส่วน GC –วิธีการบรรยายโดยนางสาวPorter et al . [ 4 ] มีลักษณะ ด้วยความเคารพของงานวิเคราะห์ ในการศึกษา เราอธิบายแบบง่าย ๆวิธีการที่เชื่อถือได้และ MS GC และการวิเคราะห์ c-triol ในพลาสมาซึ่งได้รับการพัฒนาโดยเฉพาะเพื่อปรับปรุงการวินิจฉัยดังกล่าวเมื่อเทียบกับ dzelatovic et al . , เราสามารถที่จะปรับปรุงมีขีด จำกัด ของการสอน ซึ่งมีลักษณะคล้ายไปที่รายงานโดย klinke et al . , เจียง et al . และ boenzi et al . สำหรับLC MS / MS ) ตามแนว วิธีของเราให้ c-triol ที่เชื่อถือได้ความมุ่งมั่นในช่วงความเข้มข้นในครอบคลุมระดับของครูในพลาสมาของมนุษย์ นอกจากนี้ มันคือโดดเด่นด้วยความแม่นยำและการกู้คืนซึ่งจะเปรียบกับ LC MS / MS ) ตามขั้นตอน ในที่สุด เราก็สามารถที่จะลดปริมาณตัวอย่างเพียง 0.1 มล. ต่อการตัดสินใจ นี้คือบวกเพิ่มโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีการวัดคาดว่าจะดำเนินการส่วนใหญ่ในผู้ป่วยเด็กห้องพักจำกัดของวัสดุตัวอย่างการสร้างวัตถุในช่วงระยะก่อนและวิเคราะห์ตัวอย่างการปรับปรุงใหม่เป็นปัญหาที่สำคัญในการวิเคราะห์ oxysterols , เพราะสารประกอบเหล่านี้สามารถเกิดขึ้นจากปฏิกิริยาของคอเลสเตอรอลด้วยออกซิเจนในอากาศ หรือ ไม่เร่งเอนไซม์ออกซิเดชันโดยได้กำหนดองค์ประกอบของเมทริกซ์ ตาม ที่เข้มงวดการบำรุงรักษาโซ่เย็นในระหว่างการขนส่งตัวอย่างกระเป๋าที่ต่ำมาก อุณหภูมิ และ / หรือ ภายใต้บรรยากาศอาร์กอนการใช้ความเย็น การสปอนนิฟิเคชั่น และกว้างขวางเข้มข้น สารต้านอนุมูลอิสระเช่นจักรภพคือซ้ำๆที่สุดสำหรับการวัด oxysterol แนะนำในโปรโตคอล[ 11 ] อย่างไรก็ตาม การทดสอบการเก็บรักษาในการศึกษานี้พบการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยใน c-triol ความเข้มข้นในเลือดทั้งหมดตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้เหมือนกัน นาน 72 ชั่วโมงในอุณหภูมิแวดล้อมหรือในตู้เย็นเป็นเวลา 1 สัปดาห์ นอกจากนี้ เราไม่ได้สังเกตประดิษฐ์สร้าง c-triol ในระหว่างการวิเคราะห์แม้ในคอเลสเตอรอลระเบียบการของเราไม่ได้เอาออกจาก oxysterolเศษส่วน เราสันนิษฐานว่า ความเสี่ยงของอุตสาหกรรมในปัจจุบันวิธีลด โดยตัวอย่างที่ง่าย และรวดเร็ว เตรียมและโดยเฉพาะ โดยการใช้ปริมาณที่สมดุลในขนาดเล็กอัดลมขวด autosampler กับเฮดสเปซน้อยกว่า และติดต่อกับอากาศออกซิเจนในระหว่างสปอนนิฟิเคชั่น การสกัด และซัลขั้นตอน นอกจากนี้ เนื่องจากการใช้ตัวแทนการจัดการที่มีประสิทธิภาพ( nmim ) ซิลิเวชันเป็นเวลาที่สั้นมาก ( 10 นาทีที่ 80 องศาเซลเซียส ) ในที่สุดเราได้ forgone การเอาออกของซิลิเวชันสารเคมีซึ่งอาจช่วยป้องกัน desilylation หลังจากตัวอย่างของคอเลสเตอรอลการเตรียมและออกซิเดชันที่ตามมา ดังนั้น ในหลักตรงกันข้ามกับ oxysterols เช่น 7-kc ซึ่งก่อนหน้านี้แนะนำเป็นเครื่องหมายการ ช่วยเหลือ c-triol ก็น่าจะสร้างขึ้นโดยอุตสาหกรรม unspecific ของคอเลสเตอรอลในตัวอย่างกระเป๋าหรือวิเคราะห์ procedurenor เจอไม่ใช่เอนไซม์การย่อยสลาย ด้วยเหตุผลนี้ c-triol ควรพิจารณาไบโอมาร์คเกอร์สำหรับการวินิจฉัยโรค NPC ที่ต้องการ ส่วน 7-kc อาจจะใช้เป็นตัวบ่งชี้ของภาวะการเก็บตัวอย่างที่ถูกต้อง สำหรับในทางปฏิบัติ เราขอแนะนำกระเป๋าตัวอย่างที่ 20 องศาเซลเซียสสำหรับช่วงเวลาสั้น ๆ ( ไม่เกิน 2 เดือน ) ในขณะที่ระยะยาวกระเป๋า ( เกิน 1 ปี ) ตัวอย่างที่ควรจะเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 80 C .ไปรษณีย์จากตัวอย่างเลือดโดยไม่ต้องเย็นเป็นไปได้ภายใน 72 ชั่วโมงสอดคล้องกับก่อนหน้านี้ ตีพิมพ์ผลการศึกษาของเราพบการเพิ่มขึ้นของระดับ c-triol ในวิชา ซึ่ง NPCการวินิจฉัยโรคได้โดยวิธีการทางชีวเคมี และยืนยันว่าโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ ความสามารถที่ยอดเยี่ยมของ c-triol ที่จะแบ่งแยกระหว่างผู้ป่วยที่ NPC และสุขภาพต่อบุคคลยืนยันโดยการวิเคราะห์ร็อค . c-triol ความเข้มข้นในพลาสมาคนได้รับผลกระทบจาก NPC ได้ยกระดับ byapproximately 8.1 เท่า ,ซึ่งมีความสอดคล้องกับข้อมูลที่ได้กับ LC MS / ฯนางสาวตามขั้นตอนที่ตีพิมพ์โดยเจียง et al . และ boenzi et al .[ 12