Protein Extraction and Western Blot

Protein Extraction and Western Blot Analysis Cells
(2106 cells/dish) were exposed to 6m M rhinacanthone or
0.1% DMSO for 2, 4 and 8 h as described above. The cells
were washed twice with cold PBS (pH 7.4) and lysed in icecold
RIPA buffer (50mM Tris–HCl, pH 7.5, 150mM NaCl,
0.5% Nonidet P-40, 1mM EDTA, 1mM dithiothreitol, 0.5%
deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)), supplemented
with 2mM leupeptin, 1mM E-64 and 2mM phenylmethylsulfonylfluoride
(PMSF). Cell lysates were forced
through a 21 gauge syringe to break up the cell aggregates
and cleared by centrifugation at 10000g for 10 min at 4 °C.
Protein concentration was determined using the Bio-Rad protein
assay. For Western blot analysis, equivalent amounts of
proteins were loaded on 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
(PAGE) and then electrotransferred to a Hybond
ECL nitrocellulose membrane. After blocking with 5% nonfat
dry milk in 0.1% Tween 20 in 20mM Tris-buffered saline
(pH 7.5) at room temperature for 1 h, the membranes were
incubated with the desired primary antibodies against Bcl-2,
Bax, AIF, Survivin, caspase-9 and caspase-3 at 4 °C for
overnight. Immunoreactive bands were then incubated with
the appropriate horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit
IgG secondary antibodies, followed by detecting with an enhanced
chemiluminescence (ECL) kit and autoradiography
with CL-XPosure film. The blots were stripped and re-probed
with anti b -actin antibody to ensure equal protein loading

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรตีนสกัดและตะวันตกทำลายเซลล์วิเคราะห์(2 106 เซลล์/จาน) ได้สัมผัสกับ rhinacanthone เมตร 6 เมตร หรือ0.1% DMSO สำหรับ 2, 4 และ 8 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เซลล์ล้าง ด้วย PBS เย็น (ค่า pH 7.4) สองครั้ง และ lysed ในเคร็ตบัฟเฟอร์ RIPA (50 มม.ทริ – HCl ค่า pH 7.5, NaCl, 150 มม.0.5% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, dithiothreitol มม. 0.5%เสริม deoxycholate, 0.1% โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS)),2 มม. leupeptin, E-64 มม. และ 2 มม. phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF) Lysates เซลล์ถูกบังคับผ่าน 21 การวัดเข็มหยุดผลเซลล์และล้าง โดยการหมุนที่ 10000 กรัมสำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้โปรตีนไบโอ-Radทดสอบ สำหรับตะวันตกทำลายวิเคราะห์ จำนวนเทียบเท่าโปรตีนถูกโหลดบน 12% SDS polyacrylamide เจอิ(หน้า) และ electrotransferred จากนั้นไป HybondECL ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน หลังจากบล็อก nonfat 5%แห้งน้ำนมในน้ำเกลือ 0.1% แต่ 20 ใน 20 มม.บัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง(pH 7.5) ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง เยื่อถูกได้รับการกกกับแอนตี้หลักที่ต้องการกับ Bcl-2Bax, AIF, Survivin, caspase-9 และ caspase-3 ที่ 4 ° C สำหรับค้างคืน วง immunoreactive ถูกแล้วได้รับการกกด้วยกระต่ายป้องกันรวมกันฮอสฮอร์สที่เหมาะสมIgG แอนตี้รอง ตามด้วยการเพิ่มการตรวจจับชุด chemiluminescence (ECL) และ autoradiographyCL XPosure ฟิล์ม จัดการปล้น และการพิสูจน์พร้อมป้องกัน b-แอนติบอดีแอกตินให้โปรตีนเท่ากับโหลด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดโปรตีนและดวงตะวันวิเคราะห์เซลล์
(2? 106 เซลล์ / จาน) ได้สัมผัสกับ 6m M rhinacanthone หรือ
DMSO 0.1% สำหรับ 2, 4 และ 8 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เซลล์ที่
ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสเย็น (pH 7.4) และ lysed ใน icecold
RIPA บัฟเฟอร์ (50mm Tris-HCl ค่า pH 7.5 150mm โซเดียมคลอไรด์,
0.5% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, dithiothreitol 1mM, 0.5%
Deoxycholate, 0.1% โซเดียม โดเดซิลซัลเฟต (SDS)) เสริม
ด้วย leupeptin 2mm, 1mM E-64 และ 2mm phenylmethylsulfonylfluoride
(PMSF) lysates เซลล์ถูกบังคับ
ผ่านเข็มฉีดยา 21 วัดที่จะทำลายมวลเซลล์
และล้างโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10000? กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 ° C.
ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้โปรตีน Bio-Rad
ทดสอบ สำหรับการวิเคราะห์ดวงตะวันจำนวนเทียบเท่า
โปรตีนถูกโหลดในวันที่ 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
(หน้า) และจากนั้น electrotransferred ไป Hybond
เมมเบรน nitrocellulose ECL หลังจากที่ปิดกั้นด้วย 5% ไม่มีน้ำมัน
นมแห้งใน Tween 20 0.1% ในน้ำเกลือ 20mm Tris บัฟเฟอร์
(pH 7.5) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเยื่อที่ถูก
บ่มกับที่ต้องการแอนติบอดีปฐมภูมิกับ Bcl-2,
แบ็กซ์, AIF, survivin, caspase-9 และ caspase-3 ที่ 4 ° C เป็นเวลา
ชั่วข้ามคืน วงดนตรีที่ Immunoreactive ถูกบ่มแล้วกับ
ที่เหมาะสมมะรุม peroxidase-ผันป้องกันกระต่าย
IgG แอนติบอดีรองตามด้วยการตรวจสอบด้วยการเพิ่ม
chemiluminescence (ECL) ชุดและ autoradiography
ด้วยฟิล์ม CL-XPosure blots ถูกปลดออกและ re-หยั่ง
กับการป้องกันแอนติบอดี -actin B เพื่อให้มั่นใจโหลดโปรตีนเท่ากับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดและการวิเคราะห์ Western blot โปรตีนเซลล์( 2106 เซลล์ / จาน ) ได้รับ rhinacanthone 6m เมตรหรือDMSO 0.1% สำหรับ 2 , 4 และ 8 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เซลล์เคยล้างสองครั้งกับ PBS เย็น ( pH 7.4 ) และ lysed ในริเอะบัฟเฟอร์ ( 50mm หรือ RIPA ) กรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 150mm เกลือ ,0.5% nonidet p-40 1mm EDTA , 1mm , บัตรแข็ง , 0.5 %ดี กซีโชเลต 0.1 โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) ) , อาหารกับ 2 mm ลูเพปติน 1mm e-64 phenylmethylsulfonylfluoride , และอเมริกา( PMSF ) เซลล์ lysates ถูกบังคับผ่านเข็ม 21 วัดที่จะทำลายเซลล์มวลรวมและการล้างโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 10000g สำหรับ 10 นาทีที่ 4 องศาความเข้มข้นของโปรตีนที่ใช้วิเคราะห์ทางชีวภาพราดโปรตีนการทดสอบ สำหรับการวิเคราะห์ Western blot เทียบปริมาณของโปรตีนถูกโหลดใน 12 % SDS polyacrylamide gel electrophoresis( หน้า ) แล้ว electrotransferred ไป hybondECL ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน หลังจากการปิดกั้นด้วย 5 % ไขมันต่ำนมแห้งใน 0.1% Tween 20 20mm ซึ่งในน้ำเกลือ( pH 7.5 ) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สามารถคือแยกระดับแอนติบอดีต่อ bcl-2 ที่ต้องการ ,ดิก caspase-9 bax AIF , และ , การศึกษาลักษณะที่ 4 ° C สำหรับเพียงชั่วข้ามคืน immunoreactive แล้วแยกวงการเปลี่ยนแปลงที่เหมาะสมและป้องกันกระต่าย .IgG รอง ตามด้วยการตรวจหาด้วยการปรับปรุงเคมีลูมิเนสเซนต์ ( ECL ) ชุดเก้าอี้รับแขก และกับ CL xposure ฟิล์ม blots ถูกปล้นและสามารถกับ Anti B - actin ) ให้โปรตีนเท่ากับโหลด