2.4. Reverse transcription and quan

2.4. Reverse transcription and quantitative PCR
RNA was purified from cell lysate using RNeasy Mini Kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen). Reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction were performed to determine relative mRNA levels as previously described (Nielsen et al., 2014).

2.5. Free fatty acid quantification
Quantification of the FFA in milk was performed using the ethyl chloroformate (ECF)-FFA method (Amer et al., 2013). In principle, an in-solution derivatisation using an ECF derivatising reagent followed by gas chromatography-mass spectrometry was used to quantify the level of individual FFA in the samples. Samples with elevated levels of FFA were diluted before derivatisation to obtain FFA-levels within the calibration curve.

2.6. Enzyme linked immunosorbent assay
Cells were plated in a 24-well plate and stimulated as described above. Cell culture medium was collected 6 h after stimulation with milk samples and again after the additional 18 h where cells had been incubated with pure cell culture medium. Samples were diluted 1:1 in 2 × TBS containing 0.1% Tween 20. Samples (100 μL) and standards (recombinant human ANGPTL4; 3485-AN, R&D Systems) prepared in TBS containing 5% milk (6 h samples) or 0.1% BSA (24 h samples) was applied on anti-ANGPTL4 coated ELISA plates (1.6 μg mL−1 polyclonal goat IgG in 0.1 m bicarbonate/carbonate buffer, AF3485, R&D Systems) for 2 h at RT. After washing the plate 4 times in PBS containing 0.1% Tween 20, the wells were incubated with a secondary biotinylated antibody to ANGPTL4 (0.8 μg mL−1 polyclonal goat IgG; BAF3485; R&D Systems) for 2 h at RT. After another washing step, samples were incubated with streptavidin-horseradish peroxidase (1:200, DY998, R&D Systems) followed by incubation with TMB solution. The reaction was stopped by adding 0.2 m H2SO4 and absorbance was measured at 450 nm on a microtitre plate spectrophotometer (Synergy 2, Bio-Tek). Each sample was measured three times, and the experiment was performed in duplicate and repeated three times.

2.7. Transfection and luciferase reporter assay
Transfection was performed as previously described (Nielsen et al., 2014). HCT 116 cells were transfected in a 96 well plate using Metafectene (Biontex, Martinsried, Germany). For each well, DNA was mixed with 2.0 × 104 cells in 100 μL growth medium. Six h after transfection, 100 μL treatment medium (2% milk samples giving a final concentration of 1%) were added to the wells. After 12 h, the cells were washed twice with PBS (200 μL well−1) and lysed with a lysis solution (20 μL well−1). Photinus and Renilla activities were measured directly in the plate using an Envision luminometer (PerkinElmer, Skovlunde, Denmark) and a luciferase assay system (Envision, PerkinElmer). Photinus activities were normalised to the corresponding renilla activities to compensate for differences in transfection efficiency.

2.8. Statistical analyses
Analyses were carried out using the statistical program R version 2.14.0. A general linear mixed model with Tukey's HSD Post Hoc test was used to compare the values. Level of significance was defined as P < 0.05. Students' t-test was used to compare the level of individual FA in the milk samples.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. กลับ transcription และ PCR เชิงปริมาณอาร์เอ็นเอที่บริสุทธิ์จาก lysate เซลล์ใช้ชุดมินิ RNeasy ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Qiagen) Transcription ย้อนกลับและปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณได้ดำเนินการเพื่อกำหนดระดับ mRNA ญาติเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (นีลเอ็ด al., 2014)2.5. ฟรีนับกรดไขมันนับของ FFA ในนมถูกดำเนินการโดยใช้ chloroformate เอทิล (ECF) -วิธี FFA (เอเมอร์ et al., 2013) หลัก derivatisation ในโซลูชันใช้รีเอเจนต์ derivatising ECF ที่ตาม spectrometry chromatography ก๊าซจำนวนมากถูกใช้เพื่อกำหนดปริมาณ FFA ในตัวอย่างแต่ละระดับ ตัวอย่างระดับสูงของ FFA ถูกทำให้เจือจางก่อน derivatisation รับระดับ FFA ในโค้งเทียบ2.6. เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assayเซลล์ถูกชุบจานดี 24 และถูกกระตุ้นที่อธิบายข้างต้น สื่อวัฒนธรรมเซลล์ถูกรวบรวม 6 h หลังการกระตุ้นด้วยตัวอย่างนม และอีกครั้งหลัง จาก h 18 เพิ่มเติมที่เซลล์มีการ incubated กับสื่อวัฒนธรรมเซลล์บริสุทธิ์ ตัวอย่าง 1:1 ที่แตกออกใน 2 ซื้อ TBS ประกอบด้วย 0.1% Tween 20 ตัวอย่าง (100 μL) และมาตรฐาน (ANGPTL4 recombinant มนุษย์ 3485-อัน R & D ระบบ) เตรียมใน TBS ประกอบด้วยนม 5% (ตัวอย่าง 6 h) หรือบีเอสเอ 0.1% (ตัวอย่าง 24 ชม) ถูกใช้ในป้องกัน ANGPTL4 เคลือบแผ่น ELISA (1.6 μg mL−1 polyclonal แพะ IgG ในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนต/คาร์บอเนต 0.1 m, AF3485, R & D ระบบ) สำหรับ h 2 ที่ RT. หลังจากล้างจาน 4 ครั้งใน PBS ประกอบด้วย 0.1% Tween 20 บ่อถูก incubated กับแอนติบอดีรอง biotinylated กับ ANGPTL4 (0.8 μg mL−1 polyclonal แพะ IgG BAF3485 R & D ระบบ) สำหรับ h 2 ที่ RT. หลังจากขั้นตอนการล้างอีก ตัวอย่างที่ incubated มี peroxidase streptavidin horseradish (1: 200, DY998, R & D ระบบ) ตาม ด้วยคณะทันตแพทยศาสตร์ด้วยโซลูชั่นของทหารไทย หยุดปฏิกิริยา ด้วยการเพิ่ม 0.2 m กำมะถัน และมีวัด absorbance ที่ 450 nm ในการ microtitre จานเครื่องทดสอบกรดด่าง (Synergy 2 ไบโอ-Tek) แต่ละอย่างถูกวัดสามครั้ง และทดลองทำในซ้ำ และทำซ้ำ 3 ครั้ง2.7 การ transfection และ luciferase โปรแกรมรายงานวิเคราะห์Transfection ที่ดำเนินการเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (นีลเอ็ด al., 2014) HCT 116 เซลล์ถูก transfected ใน 96 มีทั้งแผ่นโดยใช้ Metafectene (Biontex, Martinsried เยอรมนี) ดีละ ดีเอ็นเอถูกผสมกับ 2.0 × 104 เซลล์ใน 100 μL เจริญเติบโตปานกลาง H 6 หลัง transfection, 100 μL รักษากลาง (ตัวอย่าง 2% นมที่ให้ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) ถูกเพิ่มเข้าไปในบ่อ หลังจาก 12 h เซลล์ถูกล้าง ด้วย PBS (200 μL well−1) สอง และ lysed กับโซลูชัน lysis (20 μL well−1) Photinus และ Renilla ถูกวัดได้โดยตรงในแผ่นที่ใช้เป็น luminometer Envision (PerkinElmer, Skovlunde เดนมาร์ก) และระบบวิเคราะห์ luciferase (Envision, PerkinElmer) กิจกรรม Photinus มี normalised กิจกรรม renilla สอดคล้องในการชดเชยความแตกต่างในประสิทธิภาพ transfection2.8. สถิติวิเคราะห์วิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมสถิติ R รุ่น 2.14.0 แบบจำลองเชิงเส้นผสมทั่วไปกับการทดสอบของ Tukey HSD โพสต์เฉพาะกิจที่ใช้เปรียบเทียบค่า ความสำคัญของระดับถูกกำหนดเป็น P < 0.05 T-ทดสอบของนักเรียนใช้การเปรียบเทียบระดับของ FA แต่ละตัวในตัวอย่างนม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 ย้อนกลับถอดความและเชิงปริมาณ PCR
RNA ของบริสุทธิ์จากเซลล์ที่ใช้ RNeasy มินิชุดตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Qiagen) ถอดความย้อนกลับและวิธี Polymerase chain reaction เชิงปริมาณได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบระดับ mRNA ญาติตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (นีลเซ่น et al., 2014). 2.5 ฟรีปริมาณกรดไขมันปริมาณ FFA ในนมได้รับการดำเนินการโดยใช้ chloroformate เอทิล (ECF) วิธีการ -FFA (Amer et al., 2013) ในหลักการ derivatisation ในการแก้ปัญหาโดยใช้น้ำยา ECF derivatising ตามด้วยมวลสาร-แก๊สโครมาถูกใช้ในการวัดปริมาณระดับของแต่ละ FFA ในตัวอย่าง ตัวอย่างที่มีระดับสูงของ FFA ถูกเจือจางก่อนที่จะได้รับ derivatisation FFA-ระดับภายในเส้นโค้งการสอบเทียบ. 2.6 เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโนเซลล์ที่ถูกชุบในแผ่น 24 หลุมและกระตุ้นตามที่อธิบายไว้ข้างต้น อาหารเลี้ยงเซลล์ที่เก็บ 6 ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้นด้วยตัวอย่างนมและอีกครั้งหลังจากที่เพิ่มเติม 18 ชั่วโมงที่เซลล์ได้รับการบ่มที่มีขนาดกลางการเพาะเลี้ยงเซลล์บริสุทธิ์ ตัวอย่างถูกเจือจาง 1: 1 ใน 2 × TBS ที่มี 0.1% Tween 20. ตัวอย่าง (100 ไมโครลิตร) และมาตรฐาน (ANGPTL4 recombinant มนุษย์; 3485-, R & D Systems) จัดทำขึ้น TBS ที่มีนม 5% (6 ตัวอย่างต่อชั่วโมง) หรือ 0.1% บีเอสเอ (24 ชั่วโมงตัวอย่าง) ถูกนำมาใช้ในการป้องกันการ ANGPTL4 เคลือบแผ่นวิธี ELISA (1.6 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 โพลี IgG แพะใน 0.1 มไบคาร์บอเนต / บัฟเฟอร์คาร์บอเนต AF3485, R & D Systems) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ RT หลังจากล้างจาน 4 ครั้งในพีบีเอสที่มี 0.1% Tween 20 หลุมถูกบ่มกับแอนติบอดี biotinylated รอง ANGPTL4 (0.8 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 โพลี IgG แพะ BAF3485; R & D Systems) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ RT หลังจากขั้นตอนการซักผ้าอีกตัวอย่างที่ถูกบ่มกับเปอร์ออกซิเด streptavidin-พืชชนิดหนึ่ง (1: 200, DY998, R & D ระบบ) ตามด้วยการบ่มเพาะกับการแก้ปัญหาทหารไทย ปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม H2SO4 0.2 เมตรและการดูดกลืนแสงวัดที่ 450 นาโนเมตรบนสเปกแผ่น microtitre (Synergy 2 ไบโอเทค) ตัวอย่างแต่ละวัดสามครั้งและการทดสอบได้รับการดำเนินการในที่ซ้ำกันและซ้ำสามครั้ง. 2.7 transfection และทดสอบนักข่าว luciferase Transfection ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (นีลเซ่น et al., 2014) HCT 116 เซลล์ถูก transfected ใน 96 แผ่นเดียวใช้ Metafectene (Biontex, Martinsried, เยอรมนี) สำหรับแต่ละดีดีเอ็นเอผสมกับ 2.0 × 104 เซลล์ใน 100 ไมโครลิตรสื่อการเจริญเติบโต หกชั่วโมงหลังจาก transfection 100 ไมโครลิตรกลางการรักษา (2% ตัวอย่างน้ำนมให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1%) ถูกเพิ่มเข้าไปในหลุม หลังจาก 12 ชั่วโมงเซลล์ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส (200 ไมโครลิตรดี 1) และ lysed กับการแก้ปัญหาสลาย (20 ไมโครลิตรดี 1) Photinus และกิจกรรม Renilla วัดโดยตรงในจานโดยใช้ luminometer Envision (PerkinElmer, Skovlunde, เดนมาร์ก) และระบบการตรวจสอบปริมาณ luciferase (Envision, PerkinElmer) กิจกรรม Photinus ถูกปกติกับกิจกรรม renilla ที่สอดคล้องกันเพื่อชดเชยความแตกต่างในประสิทธิภาพ transfection. 2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมทางสถิติรุ่น R 2.14.0 รูปแบบการผสมทั่วไปเส้นตรงกับของ Tukey HSD โพสต์ Hoc ทดสอบถูกใช้ในการเปรียบเทียบค่า ระดับนัยสำคัญถูกกำหนดเป็น P <0.05 นักศึกษา t-test ถูกใช้ในการเปรียบเทียบระดับของแต่ละเอฟเอในตัวอย่างน้ำนม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . ถอดความย้อนกลับและ RNA PCR
ปริมาณบริสุทธิ์จาก lysate เซลล์โดยใช้ชุดมินิ rneasy ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ( เพิ่ม ) ถอดความย้อนกลับและปริมาณการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ได้ทำการศึกษาระดับของญาติตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Nielsen et al . , 2010 ) .

2.5
ปริมาณกรดไขมันอิสระปริมาณของ FFA ในนมมีการใช้สารคลอโรฟอร์เมต ( ecf ) - วิธี FFA ( Amer et al . , 2013 ) ในหลักการ ในการใช้โซลูชั่น derivatisation ecf derivatising รีเอเจนต์ตามด้วยก๊าซสัปดาห์รีใช้วัดระดับของ FFA ในแต่ละตัวอย่างตัวอย่างที่มีระดับสูงของ FFA เป็นเจือจางก่อน derivatisation ขอรับ FFA ระดับภายในรูปโค้ง .

2.6 เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay
เซลล์มีการชุบใน 24 ดีจานและกระตุ้นตามที่อธิบายไว้ข้างต้นการเพาะเลี้ยงเซลล์กลางรวบรวม 6 ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้นด้วยตัวอย่างนมและอีกครั้งหลังจากเพิ่มเติม 18 H ที่เซลล์ได้รับการแยกเชื้อบริสุทธิ์ เซลล์ปานกลาง ตัวอย่างที่เจือจาง 1 : 1 ใน 2 × TBS ที่ประกอบด้วย 0.1% Tween 20 ตัวอย่าง ( 100 μ L ) และมาตรฐาน ( recombinant มนุษย์ angptl4 ; 3485-an R & D ระบบ ) ที่เตรียมไว้ใน TBS ที่มีถึง 5 % นม ( ตัวอย่าง 6 H ) หรือ 01 % BSA ( 24 ชั่วโมงตัวอย่าง ) คือใช้วิธี anti-angptl4 เคลือบแผ่น ( 1.6 μ G − 1 ml ใช้แพะ IgG ใน 0.1 โมลาร์ ไบคาร์บอเนต / คาร์บอเนตบัฟเฟอร์ af3485 R & D ระบบ ) 2 H ที่ RT . หลังจากล้างจาน 4 ครั้งใน PBS ที่ประกอบด้วย 0.1% Tween 20 , บ่อถูกบ่มด้วย มัธยม ( angptl4 ไล ( 0.8 มิลลิลิตรμ G − 1 ใช้แพะ IgG ; baf3485 ; R & D ระบบ ) 2 H ที่ RT .หลังอีกซักก้าว กลุ่มตัวอย่างทั้งสอง streptavidin มะรุม เปอร์ออกซิเดส ( 1:200 dy998 , R & D ระบบ ) ตามด้วยธนาคารบ่มด้วยโซลูชั่น ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดโดยการเพิ่ม 0.2M กรดซัลฟิวริกและค่าวัด 450 nm ใน microtitre Spectrophotometer ( 2 แผ่น ( ไบโอเทค ) แต่ละตัวอย่างถูกวัด 3 ครั้งและทดสอบในที่ซ้ำกันและซ้ำสามครั้ง

2.7 . สำหรับการทดสอบและการรายงานสำหรับลูซิเฟอเรส
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Nielsen et al . , 2010 ) โรเซลล์จำนวน 116 transfected ใน 96 จานใช้ดี metafectene ( biontex martinsried , เยอรมนี ) สำหรับแต่ละคือ ดีเอ็นเอ มาผสมกับ 2.0 × 104 เซลล์ใน 100 μผมการเจริญเติบโตปานกลาง หลังจาก transfection 6 H ,100 μกลางรักษา L ( 2% นมตัวอย่างให้ความเข้มข้นสุดท้าย 1 % ) ถูกเพิ่มไปยังหลุม หลังจาก 12 ชม. เซลล์ก็ล้างสองครั้งกับ PBS ( 200 μอืม− 1 ) และ lysed ด้วยโซลูชั่นการสลาย ( 20 μอืม− 1 ) โฟตินัส และ renilla กิจกรรมที่วัดโดยตรงในจานใช้วาดภาพ ลูมิโนมิเตอร์ ( Perkinelmer skovlunde , เดนมาร์ก ) และเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( envision ระบบ , การทดสอบPerkinelmer ) กิจกรรมโฟตินัสถูกบันทึกเพื่อกิจกรรม renilla ที่สอดคล้องกันเพื่อชดเชยความแตกต่างในประสิทธิภาพสำหรับ

2.8 . การวิเคราะห์สถิติวิเคราะห์
ทดลองการใช้โปรแกรมสถิติ R รุ่น 2.14.0 . แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไปผสมกับวิธีการทดสอบหาทดสอบใช้เพื่อเปรียบเทียบค่า ระดับความสำคัญที่ถูกกำหนดไว้ที่ P < 0.05นักเรียนใช้ t-test เพื่อเปรียบเทียบระดับฟ้าบุคคลในนมตัวอย่าง