Cell-based assay methods are now ro

Cell-based assay methods are now routinely incorporated into high throughput screening activities for drug discovery and development (Digan, 2005; Boisclair, 2005). Automated dispensing and ancillary robotic systems make it possible to rapidly and efficiently interrogate a compound library for biological effects on a target cell population. As assay well densities increase and volumes plummet however, new physical constraints and practical hurdles commonly emerge that negatively impact reproducibility and sensitivity (Rose, 1997; Maffia, 1999). Therefore, new robust and scalable reagents are sought to produce higher quality data in a cost-effective manner.

Cytotoxicity is one of the most common biological parameters measured after experimental manipulation largely because it is easily measured and adheres to the dose-dependence paradigm of Paracelsus. It is well known that many drugs produce physiological and therapeutic actions at lower concentrations while the toxic effects including necrosis or apoptosis occur at higher concentrations. Regardless of the mechanism of cell death, mammalian cells after interacting with toxins undergo a series of dramatic structural and morphological changes that lead to loss of membrane integrity (Leist, 2001). This irreparable damage to cellular architecture allows free movement of previously excluded molecules into the cell, as well as their enzymatic contents to leak into the culture medium (Riss, 2004). Therefore, measurement of intracellular enzyme marker activity in the extra-cellular environment is the basis of several cytotoxicity assays for accessing cell membrane integrity.

Currently, several cell-based cytoxicity assays are available for determining cell membrane integrity. Dye uptake assays using neutral red, trypan blue and fluorescent compounds such as propidium iodide are traditional methods to assess cell viability and membrane damage. Trypan blue and fluorescent compounds such as propidium iodide are excluded by healthy, functional cell membranes but are able to traverse damaged cell membranes thereby preferentially staining dead cells. Conversely, neutral red accumulates only in the lysosomes of viable cells. The lactate dehydrogenase (LDH) release assay is widely used in in vitro toxicology studies. This assay is based on the measurement of LDH activity in the extracellular medium. Membrane integrity can be also evaluated by other enzyme release assays including adenylate kinase (Olsson et al., 1983) or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Corey et at., 1997), which are present in all cells. These enzymes are normally compartmentalized within the cell, but their activities are significantly increased in the extracellular environment as a result of cell death. However, these assays have their limitations including multiple reagent additions, low sensitivity, low-throughput and scalability, poor linearity, and the need for requisite washes or medium exchanges.

Although many assay methods have been developed for determining cytotoxicity in lower density formats, precious few have been validated for use in high throughput screening that requires simple, homogenous assay procedure with robust assay signal. Niles et al. recently described a novel proteolytic biomarker profile for cytotoxicity that embodies many biological attributes desirable for robust assay development (Niles et al., 2007). Subsequently, a homogenous luminescent assay was developed for measuring this biomarker that comprises a formulation containing an aminoluciferin-conjugated substrate, ATP, MgSO4 and a thermostable, recombinant luciferase (Figure 1). We describe here the development and validation of a bioluminescent cytotoxicity assay using a protease biomarker in a 1536-well plate format, by the screening of the1408 compound collection from National Toxicology Program (NTP) (Xia et al., 2008). We have identified several known and novel membrane disrupters by screening NTP library, which indicates that the assay is robust and suitable for large scale library screening.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีวิเคราะห์ตามเซลล์ตอนนี้เป็นประจำรวมอยู่ในอัตราความเร็วสูงที่ตรวจค้นพบยาเสพติดและการพัฒนา (Digan, 2005 กิจกรรม Boisclair, 2005) มหาศาลไปโดยอัตโนมัติ และระบบหุ่นยนต์พิเศษให้ได้อย่างรวดเร็ว และมีประสิทธิภาพซักรีผสมสำหรับผลกระทบทางชีวภาพประชากรเซลล์เป้าหมาย เป็น assay ดี plummet เพิ่มขึ้นและปริมาณความหนาแน่นอย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดทางกายภาพใหม่และอุปสรรคการปฏิบัติโดยทั่วไปเกิดที่ส่งผลกระทบต่อ reproducibility ความระมัดระวัง (โรส 1997 Maffia, 1999) ดังนั้น reagents แข็งแกร่ง และสามารถต่อขยายใหม่จะขอผลิตข้อมูลคุณภาพสูงได้อย่างมีประสิทธิภาพCytotoxicity เป็นหนึ่งในพารามิเตอร์ชีวภาพทั่ววัดหลังการทดลองส่วนใหญ่เนื่องจากวัดได้ง่าย และสอดคล้องกับกระบวนทัศน์พึ่งพายาของ Paracelsus เป็นที่รู้จักกันดีว่า ยาเสพติดจำนวนมากผลิตสรีรวิทยา และรักษาการดำเนินการที่ความเข้มข้นต่ำกว่าในขณะที่ผลกระทบพิษรวมทั้งการตายเฉพาะส่วน หรือ apoptosis เกิดขึ้นที่ความเข้มข้นสูง โดยกลไกในการตายของเซลล์ เซลล์ mammalian หลังจากโต้ตอบกับสารพิษรับละครสัณฐาน และโครงสร้างเปลี่ยนแปลงที่นำไปสู่การสูญเสียความสมบูรณ์ของเมมเบรน (Leist, 2001) ความเสียหายนี้การชะงักสถาปัตยกรรมโทรศัพท์มือถือช่วยให้การเคลื่อนย้ายของโมเลกุลที่แยกไว้ก่อนหน้านี้ลงในเซลล์ ตลอดจนเนื้อหาของเอนไซม์ในระบบรั่วไหลเป็นสื่อวัฒนธรรม (Riss, 2004) ดังนั้น การวัดเอนไซม์ intracellular กิจกรรมเครื่องในสภาพแวดล้อมพิเศษโทรศัพท์มือถือเป็นพื้นฐานของ assays cytotoxicity หลายสำหรับการเข้าถึงความสมบูรณ์ของเซลล์เมมเบรนปัจจุบัน assays cytoxicity ตามเซลล์ต่าง ๆ มีการกำหนดความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ ใช้สีแดงกลาง assays ของดูดซับสีย้อม trypan blue และฟลูออเรสสารประกอบเช่นไอโอไดด์ propidium เป็นวิธีดั้งเดิมในการประเมินความเสียหายชีวิตและเยื่อหุ้มเซลล์ Trypan blue และฟลูออเรสสารประกอบเช่น propidium ไอโอไดด์จะถูกแยกออกจากเยื่อหุ้มเซลล์มีสุขภาพดี ทำงาน แต่สามารถข้ามเยื่อหุ้มเซลล์เสียหายโน้ตจึงย้อมสีเซลล์ตาย ในทางกลับกัน สีแดงกลางสะสมเฉพาะใน lysosomes ของเซลล์ทำงานได้ ทดสอบนำ lactate dehydrogenase (LDH) มีใช้แพร่หลายในการศึกษาพิษวิทยาใน ทดสอบนี้ตั้งอยู่ที่วัดกิจกรรม LDH ในสื่อ extracellular เมมเบรนความสามารถยังประเมิน โดย assays อื่น ๆ ปล่อยเอนไซม์ adenylate kinase (Olsson et al., 1983) รวมถึง dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) หรือ (Corey และ at., 1997), ซึ่งมีอยู่ในเซลล์ทั้งหมดได้ เอนไซม์เหล่านี้มี compartmentalized ภายในเซลล์ปกติ แต่กิจกรรมที่เพิ่มในสภาพแวดล้อม extracellular จากเซลล์ตาย อย่างไรก็ตาม assays เหล่านี้มีข้อจำกัดของพวกเขารวมทั้งส่วนเพิ่มเติมรีเอเจนต์หลาย ความไวต่ำ อัตราความ เร็วต่ำขนาด แบบดอกไม้ที่ดี และต้องจำเป็น washes หรือแลกเปลี่ยนกลางแม้ว่าวิธีวิเคราะห์จำนวนมากได้รับการพัฒนาสำหรับการกำหนดในรูปแบบความหนาแน่นลด cytotoxicity สิ่งล้ำค่าได้รับการตรวจสอบเพื่อใช้ในการคัดกรองอัตราความเร็วสูงที่ต้องใช้กระบวนการวิเคราะห์อย่างง่าย ให้ มีประสิทธิภาพวิเคราะห์สัญญาณ Al. Niles ร้อยเอ็ดเพิ่งอธิบายโปรไฟล์ไบโอมาร์คเกอร์ proteolytic นวนิยาย cytotoxicity ที่ผสานคุณลักษณะชีวภาพในการพัฒนาวิเคราะห์ประสิทธิภาพ (Niles et al., 2007) ในเวลาต่อมา การทดสอบ luminescent ให้ถูกพัฒนาขึ้นสำหรับวัดนี้ไบโอมาร์คเกอร์ที่ประกอบด้วยการกำหนดพื้นผิวการ aminoluciferin กลวง ATP, MgSO4 และ luciferase เป็น thermostable, recombinant (รูปที่ 1) เราอธิบายต่อการพัฒนาและการตรวจสอบวิเคราะห์ bioluminescent cytotoxicity ที่ใช้เป็นรติเอสไบโอมาร์คเกอร์ในรูปแบบแผ่นดี 1536 คัดกรองของคอลเลกชันผสม the1408 จากชาติพิษวิทยาโปรแกรม (NTP) (เซี่ย et al., 2008) เราได้ระบุ disrupters เมมเบรนรู้จัก และนวนิยายหลาย โดยคัดกรอง NTP ไลบรารี ซึ่งบ่งชี้ว่า การวิเคราะห์มีประสิทธิภาพ และเหมาะสมสำหรับคัดกรองไลบรารีขนาดใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มือถือที่ใช้วิธีการทดสอบในขณะนี้ได้มีการรวบรวมเป็นประจำในกิจกรรมการตรวจคัดกรองผ่านสูงสำหรับการค้นพบยาเสพติดและการพัฒนา (Digan 2005; Boisclair 2005) จ่ายโดยอัตโนมัติและเสริมระบบหุ่นยนต์ให้เป็นไปได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพสอบปากคำห้องสมุดสารประกอบสำหรับผลกระทบทางชีวภาพในเซลล์เป้าหมายประชากร ในฐานะที่เป็นดีทดสอบความหนาแน่นเพิ่มขึ้นและปริมาณการดิ่ง แต่ จำกัด ทางกายภาพใหม่และอุปสรรคในทางปฏิบัติทั่วไปโผล่ออกมาที่ส่งผลกระทบต่อการทำซ้ำในเชิงลบและความไว (โรส 1997; Maffia, 1999) ดังนั้นน้ำยาแข็งแกร่งและสามารถขยายใหม่จะพยายามที่จะผลิตข้อมูลที่มีคุณภาพที่สูงขึ้นในลักษณะที่มีประสิทธิภาพ. Cytotoxicity เป็นหนึ่งในพารามิเตอร์ทางชีวภาพที่พบมากที่สุดวัดหลังจากจัดการทดลองส่วนใหญ่เพราะมันจะวัดได้อย่างง่ายดายและปฏิบัติตามกระบวนทัศน์ปริมาณการพึ่งพาอาศัยกันของพาราเซลซัส . เป็นที่ทราบกันดีว่ายาเสพติดจำนวนมากผลิตการกระทำทางสรีรวิทยาและการรักษาที่ระดับความเข้มข้นลดลงในขณะที่ความเป็นพิษรวมถึงการตายของเซลล์เนื้อร้ายหรือเกิดขึ้นที่ระดับความเข้มข้นที่สูงขึ้น โดยไม่คำนึงถึงกลไกการตายของเซลล์เซลล์หลังจากที่เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีสารพิษที่มีปฏิสัมพันธ์ผ่านชุดของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่น่าทึ่งที่นำไปสู่การสูญเสียความสมบูรณ์ของเมมเบรน (Leist, 2001) นี้เสียหายไม่สามารถแก้ไขสถาปัตยกรรมโทรศัพท์มือถือที่ช่วยให้การเคลื่อนไหวของโมเลกุลฟรียกเว้นก่อนหน้านี้ลงในเซลล์เช่นเดียวกับเนื้อหาของเอนไซม์ของพวกเขาที่จะรั่วไหลลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ (Riss, 2004) ดังนั้นการวัดของกิจกรรมเครื่องหมายเอนไซม์ภายในเซลล์ในสภาพแวดล้อมที่พิเศษโทรศัพท์มือถือเป็นพื้นฐานของการตรวจพิษหลายสำหรับการเข้าถึงความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์. ปัจจุบันหลายเซลล์ที่ใช้ตรวจ cytoxicity ที่มีอยู่ในการพิจารณาของเซลล์เมมเบรนสมบูรณ์ ย้อมตรวจการดูดซึมโดยใช้สีแดงเป็นกลางสารเรืองแสงสีฟ้าและ Trypan เช่นไอโอไดด์ propidium เป็นวิธีการแบบเดิมในการประเมินความมีชีวิตและความเสียหายของเซลล์เมมเบรน Trypan สารเรืองแสงสีฟ้าและสีเช่นไอโอไดด์ propidium ได้รับการยกเว้นจากการมีสุขภาพดีเยื่อหุ้มเซลล์ทำงาน แต่สามารถที่จะเข้าไปในเยื่อหุ้มเซลล์ที่เสียหายจึงชอบการย้อมสีเซลล์ที่ตายแล้ว ตรงกันข้ามสีแดงเป็นกลางสะสมเฉพาะใน lysosomes ของเซลล์ที่ทำงานได้ นม dehydrogenase (LDH) ทดสอบปล่อยถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาในหลอดทดลองทางพิษวิทยา การทดสอบนี้จะขึ้นอยู่กับการวัดของกิจกรรม LDH ในกลางใน extracellular ความสมบูรณ์ของเมมเบรนสามารถยังประเมินโดยการตรวจปล่อยเอนไซม์อื่น ๆ รวมทั้งไคเนสเลท (โอลส์สัน et al., 1983) หรือ dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) (คอเรย์ที่เอ., 1997) ซึ่งมีอยู่ในทุกเซลล์ เอนไซม์เหล่านี้จะ compartmentalized ปกติภายในเซลล์ แต่กิจกรรมของพวกเขาจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสภาพแวดล้อมนอกเป็นผลมาจากการตายของเซลล์ อย่างไรก็ตามการตรวจเหล่านี้มีข้อ จำกัด ของพวกเขารวมถึงการเพิ่มสารหลายความไวต่ำผ่านต่ำและขยายขีดความสามารถเชิงเส้นยากจนและความจำเป็นในการล้างที่จำเป็นหรือการแลกเปลี่ยนกลาง. แม้ว่าวิธีการทดสอบจำนวนมากได้รับการพัฒนาสำหรับการกำหนดความเป็นพิษในรูปแบบที่ต่ำกว่าความหนาแน่นของที่มีค่า ไม่กี่ได้รับการตรวจสอบเพื่อใช้ในการตรวจคัดกรองผ่านสูงที่ต้องใช้ง่ายขั้นตอนการทดสอบคุณสมบัติเหมือนกันกับสัญญาณทดสอบที่แข็งแกร่ง ไนล์ et al, เมื่อเร็ว ๆ นี้อธิบายรายละเอียด biomarker โปรตีนใหม่สำหรับพิษที่คาดเดาคุณลักษณะที่พึงประสงค์หลายทางชีวภาพเพื่อการพัฒนาทดสอบประสิทธิภาพ (ไนล์ et al., 2007) ต่อจากนั้นทดสอบเรืองแสงเป็นเนื้อเดียวกันได้รับการพัฒนาสำหรับการวัด biomarker นี้ที่ประกอบด้วยสูตรที่มีส่วนผสมของสารตั้งต้น aminoluciferin-ผันที่เอทีพี MgSO4 และอุณหภูมิ, recombinant luciferase (รูปที่ 1) ที่นี่เราจะอธิบายการพัฒนาและการตรวจสอบของการทดสอบความเป็นพิษเรืองแสงใช้ biomarker โปรติเอสในรูปแบบแผ่น 1536 ดีโดยการคัดกรองของการเก็บสาร the1408 จากโปรแกรมพิษวิทยาแห่งชาติ (NTP) (เซี่ย et al., 2008) เราได้ระบุหลายที่รู้จักและ disrupters เยื่อนิยายของการตรวจคัดกรองห้องสมุด NTP ซึ่งบ่งชี้ว่าการทดสอบเป็นที่แข็งแกร่งและเหมาะสำหรับการตรวจคัดกรองห้องสมุดขนาดใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์ตามวิธีการตรวจในขณะนี้โดยรวมสูง throughput กลั่นกรองกิจกรรมสำหรับการค้นพบและพัฒนายา ( digan , 2005 ; boisclair , 2005 ) จ่ายยาอัตโนมัติ และระบบหุ่นยนต์ ancillary ให้มันเป็นไปได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ สอบสวนและห้องสมุดสำหรับผลกระทบทางชีวภาพบนเซลล์เป้าหมายประชากรเป็น การทดสอบความหนาแน่นเพิ่มขึ้น และปริมาณก็ดิ่งอย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดและอุปสรรคทางกายภาพใหม่ในทางปฏิบัติมักโผล่ที่ส่งผลกระทบในทางลบตรวจสอบและความไว ( กุหลาบ , 1997 ; maffia , 1999 ) เพราะฉะนั้น ใหม่ที่แข็งแกร่งและยืดหยุ่นเพื่อขอผลิตข้อมูลคุณภาพสูงในลักษณะที่ประหยัดต้นทุน .

มะเร็งเป็นหนึ่งในที่พบมากที่สุดชีวภาพวัดหลังจากทดลองการจัดการส่วนใหญ่เพราะมันวัดได้ง่ายและสอดคล้องกับการใช้กระบวนทัศน์ของพาราเซลซัส . มันเป็นที่รู้จักกันดีว่าหลายยาเสพติดผลิตทางสรีรวิทยาและการกระทำที่ความเข้มข้นต่ำในขณะที่พิษรวมทั้งการวาดเส้นหรือ apoptosis เกิดขึ้นที่ความเข้มข้นสูงโดยไม่คำนึงถึงกลไกการตายของเซลล์ เซลล์ mammalian หลังจากการโต้ตอบกับสารพิษผ่านชุดของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่น่าทึ่ง ทำให้สูญเสียความสมบูรณ์ของเมมเบรน ( leist , 2001 ) นี้แก้ไขไม่ได้ ความเสียหายกับสถาปัตยกรรมมือถือช่วยให้การเคลื่อนไหวของการยกเว้นก่อนหน้านี้โมเลกุลฟรีในมือถือรวมทั้งเนื้อหาของเอนไซม์ที่รั่วไหลลงในวัฒนธรรมขนาดกลาง ( ริส , 2004 ) ดังนั้นการวัดเซลล์ของเอนไซม์เครื่องหมายกิจกรรมในสภาพแวดล้อมที่มือถือเสริมพื้นฐานของวิธีการหลายเซลล์สำหรับการเข้าถึงเยื่อเซลล์สมบูรณ์

ปัจจุบันหลายปัจจุบัน ) มีกำหนด cytoxicity เยื่อหุ้มเซลล์ความซื่อสัตย์การใช้สีที่เป็นกลางหรือสีแดง , สีฟ้าเรืองแสงไตรแพนและสารประกอบ เช่น propidium ไอโอไดด์เป็นวิธีการแบบดั้งเดิมเพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์เมมเบรนและความเสียหาย ไตรแพนสีฟ้าเรืองแสงและสารประกอบ เช่น propidium ไอโอไดด์จะถูกแยกออกโดยสุขภาพ การทำงาน เยื่อหุ้มเซลล์ แต่สามารถที่จะเข้าไปทำลายเยื่อหุ้มเซลล์จึง preferentially คราบเซลล์ที่ตายแล้ว ในทางกลับกันสีแดงกลางสะสมเฉพาะในไลโซโซมของใช้เซลล์ และ lactate dehydrogenase ( LDH ) รุ่นทดสอบที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อวิทยาศึกษา วิธีนี้อาศัยการวัดกิจกรรมในกลางและหลัง . เยื่อที่สมบูรณ์สามารถประเมินโดยวิธีปล่อยเอนไซม์อื่น ๆ รวมทั้งการนำเสนอภาพนิ่งไคเนส ( โอลส์สัน et al . ,1983 ) หรือ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( gapdh ) ( Corey et . , 1997 ) ซึ่งมีอยู่ในทุกเซลล์ เอนไซม์เหล่านี้โดยปกติจะถูกแบ่งแยกภายในเซลล์ แต่กิจกรรมของพวกเขาจะเพิ่มขึ้นในสภาพแวดล้อมที่สำคัญ เป็นผลให้เซลล์ตาย อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้มีข้อ จำกัด ของพวกเขา รวมถึงหลายสารเคมีที่ใช้เพิ่มความไวต่ำสูงต่ำและ scalability , ถึงยากจน และต้องล้างที่จำเป็นหรือแลกเปลี่ยนสื่อ

ถึงแม้ว่าการทดสอบมากมายได้ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อกำหนดความเป็นพิษในรูปแบบความหนาแน่นต่ำน้อยได้รับการตรวจสอบเพื่อใช้ในการคัดกรองสูง throughput ที่ใช้ง่าย ขั้นตอนการทดสอบ การทดสอบเนื้อเดียวกันกับสัญญาณที่แข็งแกร่ง ไนล์ et al .เมื่อเร็ว ๆนี้อธิบายนวนิยายโปรตีนไบโอมาร์คเกอร์โปรไฟล์สำหรับเซลล์ที่ embodies คุณลักษณะทางชีวภาพมากมายพึงปรารถนาเพื่อการพัฒนาการทดสอบประสิทธิภาพ ( Niles et al . , 2007 ) ต่อมาเป็นเนื้อเดียว โดยรวม พัฒนาวัดนี้ไบโอมาร์คเกอร์ที่ประกอบด้วยสูตรที่มี aminoluciferin conjugated ตั้งต้น และสร้างสาร ATP MgSO4 ใ , ,รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( รูปที่ 1 ) เราอธิบายที่นี่การพัฒนาและตรวจสอบความตรงของไบโอลูมิเนสเซนต์ต่อการทดสอบโดยใช้โปรตีนไบโอมาร์คเกอร์ในรูปแบบคู่ดีจาน โดยการคัดเลือก the1408 ผสมคอลเลกชันจากโปรแกรมพิษวิทยาแห่งชาติ ( NTP ) ( Xia et al . , 2008 ) เราได้ระบุหลายที่รู้จักและ disrupters เยื่อนวนิยายโดยห้องสมุด NTP การคัดกรอง ,ซึ่งบ่งชี้ว่าแบคทีเรียที่แข็งแกร่ง และเหมาะสมสำหรับการคัดกรอง
ห้องสมุดขนาดใหญ่