2.3. Experimental set-upDucks were

2.3. Experimental set-up
Ducks were individually identified and randomly divided into
two groups with four animals each, one experimental and one
control group. Each group was housed together in a negatively
pressurized isolator unit, was provided with feed and water ad
libitum and was acclimatized for 5 days prior to inoculation. The
ducks in the experimental group were inoculated with a total
inoculum of 1
104 TCID50 of the virus in 3 ml PBS, of which 1.5 ml
was inoculated intratracheally and 1.5 ml intraesophageally. The
dose was the same as that used by Keawcharoen et al. (2008) to
allow comparison with that study, in which the low dose had been
selected to simulate field conditions and to increase the chance of
producing a productive infection without clinical disease. The four
ducks in the control group were sham-inoculated with the same
volume and by the same route.
The weight of the ducks was recorded daily. Abnormal behavior
and nervous signs were recorded daily according to a standardized
protocol by a veterinarian. To monitor virus excretion, cloacal and
pharyngeal swabs were collected daily, centrifuged, divided into
three aliquots and frozen at 70 C for later viral isolation and
reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Blood
was collected for serology and for virus isolation 5 days before
inoculation and on the day of necropsy. All ducks were euthanized
by exsanguination under isoflurane anesthesia four dpi or earlier if
they developed severe clinical signs (one duck). Necropsies were
carried out and tissue samples were collected for histopathology,
immunohistochemistry (IHC), and virus isolation. The study was
approved by an independent Animal Care and Use Committee, The
Netherlands. All procedures were carried out under Biosafety Level
3+ conditions.
2.4. Pathology, histology and immunohistochemistry (IHC)
The following tissues were collected for histopathology: middle
nasal concha, caudal nasal concha, Harderian gland, eye, brain,
ophthalmic branch of the trigeminal nerve, air sacs (left and right
cervical and left and right posterior thoracic and abdominal),
trachea, lung (left and right including main bronchus), esophagus,
proventriculus, ventriculus, duodenum (section through middle
part), three sections of jejunum, Meckel’s diverticulum, ileo-cecal
junction, colon (section through the middle part), bursa of
Fabricius, liver, kidney, spleen, heart, pectoral muscle, skin, gonad
(testis or ovary), adrenal gland, thymus, thyroid, and bone marrow.
To sample the jejunum, it was first divided into five equal parts.
Three 8-cm-long strips were taken, one each from the first (most
proximal), third, (middle), and fifth (most distal) parts. The
sections of intestine were cut open lengthwise and then rolled up
on wooden sticks before fixation.
The tissues were fixed in 10% neutral-buffered formalin,
routinely processed and cut. From each block, one section was
stained with hematoxylin and eosin (H&E) and one was used for
IHC to detect influenza virus antigen as previously described
(Keawcharoen et al., 2008). Presence of viral antigen was assessed
semi-quantitatively (0 = no antigen, 1 = few positive cells, 2 = moderate
number of positive cells, and 3 = many positive cells).
2.5. RT-PCR and virus isolation
Isolation of RNA and RT-PCR were performed on all cloacal and
pharyngeal swabs as described previously (Ward et al., 2004). A
MagnaPure LC system with the MagnaPure Total nucleic acid
isolation kit (Roche Diagnostics, Almere, the Netherlands) was
used to isolate RNA. An ABI 7500 sequence Detection System with
the TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents kit (Applied BioSystems,
Nieuwerkerk aan den Ijssel, The Netherlands) was then used to
perform the real time RT-PCR analyses to detect the influenza

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 ทดลองตั้งค่าเป็ดถูกระบุรายบุคคลและแบ่งเป็นสองกลุ่มที่มีสี่สัตว์แต่ละหนึ่งหนึ่งทดลองและกลุ่มควบคุม แต่ละกลุ่มจะตั้งอยู่ด้วยกันในทางลบหน่วย isolator แรงดันให้กับอาหารและน้ำโฆษณาเต็มที่และได้รับการปรับสภาพเป็นเวลา5 วันก่อนที่จะมีการฉีดวัคซีน เป็ดในกลุ่มทดลองที่ได้รับเชื้อมีจำนวนเชื้อ 1? 104 TCID50 ของไวรัสใน 3 มล. พีบีเอสที่ 1.5 มล. ได้รับเชื้อ intratracheally 1.5 มล. intraesophageally ยาเป็นเช่นเดียวกับที่ใช้โดย Keawcharoen et al, (2008) ที่จะช่วยให้การเปรียบเทียบกับการศึกษานั้นซึ่งในขนาดต่ำได้รับการคัดเลือกเพื่อจำลองสภาพสนามและเพื่อเพิ่มโอกาสของการผลิตการติดเชื้อการผลิตที่ไม่มีโรคทางคลินิก สี่เป็ดในกลุ่มควบคุมที่ถูกหลอกลวง-เชื้อเดียวกับปริมาณและเส้นทางเดียวกัน. น้ำหนักของเป็ดที่ถูกบันทึกไว้ในชีวิตประจำวัน พฤติกรรมที่ผิดปกติและสัญญาณประสาทที่ถูกบันทึกไว้ในชีวิตประจำวันเป็นไปตามมาตรฐานโปรโตคอลโดยสัตวแพทย์ ในการตรวจสอบการขับถ่ายไวรัส cloacal และswabs เชอรี่ที่ถูกเก็บรวบรวมรายวัน, ปั่นแบ่งออกเป็นสามaliquots และแช่แข็งที่ 70 องศาเซลเซียสในการแยกเชื้อไวรัสในภายหลังและโพลิเมอร์ถอดความกลับปฏิกิริยาลูกโซ่(RT-PCR) เลือดถูกเก็บไว้สำหรับเซรุ่มวิทยาและการแยกเชื้อไวรัส 5 วันก่อนการฉีดวัคซีนและในวันที่ชันสูตรศพ เป็ดทั้งหมดถูก euthanized ด้วยการเอาภายใต้ยาชา isoflurane สี่ dpi หรือก่อนหน้าถ้าพวกเขาพัฒนาอาการรุนแรง(หนึ่งเป็ด) necropsies ถูกดำเนินการและตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกเก็บรวบรวมสำหรับจุลพยาธิวิทยา, immunohistochemistry (IHC) และการแยกเชื้อไวรัส การศึกษาได้รับการอนุมัติโดยอิสระดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการที่เนเธอร์แลนด์ ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการภายใต้ความปลอดภัยทางชีวภาพระดับสภาพ 3+. 2.4 พยาธิวิทยาจุลและ immunohistochemistry (IHC) เนื้อเยื่อต่อไปนี้ถูกเก็บไว้สำหรับจุลพยาธิวิทยา: กลางเนตจมูกเนตจมูกหางต่อมHarderian ตา, สมอง, สาขาโรคตาของเส้นประสาท trigeminal, ถุงลม (ซ้ายและขวาปากมดลูกและซ้ายและหลังด้านขวาทรวงอกและช่องท้อง), หลอดลมปอด (ซ้ายและขวารวมทั้งหลักหลอดลม) หลอดอาหารproventriculus, ventriculus, ลำไส้เล็กส่วนต้น (ส่วนผ่านกลางบางส่วน) สามส่วนของการวาดภาพ, ผนังอวัยวะ Meckel ของ ileo-cecal แยกลำไส้ใหญ่ (มาตราผ่านกลาง บางส่วน) Bursa ของFabricius, ตับ, ไตม้ามหัวใจกล้ามเนื้อหน้าอก, ผิวหนังอวัยวะสืบพันธุ์(อัณฑะหรือรังไข่), ต่อมหมวกไตไธมัสต่อมไทรอยด์และไขกระดูก. เพื่อลิ้มลองวาดภาพนั้นจะถูกแบ่งออกเป็นครั้งแรกเป็นห้าเท่ากัน ชิ้นส่วน. สามแถบ 8 ซม. ยาวถูกนำแต่ละคนจากครั้งแรก (ส่วนใหญ่ใกล้เคียง) ที่สาม (กลาง) และห้า (ปลายมากที่สุด) ชิ้นส่วน ส่วนของลำไส้ถูกตัดตามยาวเปิดแล้วรีดขึ้นบนแท่งไม้ก่อนที่จะตรึง. เนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขใน 10% ฟอร์มาลินเป็นกลางบัฟเฟอร์, การประมวลผลและตัดเป็นประจำ จากบล็อกแต่ละส่วนหนึ่งถูกย้อมด้วยสี hematoxylin และ Eosin (H & E) และอีกคนหนึ่งที่ใช้สำหรับการ IHC เพื่อตรวจหาแอนติเจนเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Keawcharoen et al., 2008) การปรากฏตัวของแอนติเจนของเชื้อไวรัสได้รับการประเมินกึ่งเชิงปริมาณ (0 = ไม่มีแอนติเจน 1 = เซลล์บวกไม่กี่ 2 = ปานกลางจำนวนของเซลล์ในเชิงบวกและ3 = เซลล์ในเชิงบวกมาก). 2.5 RT-PCR และการแยกเชื้อไวรัสแยกของอาร์เอ็นเอและRT-PCR ได้ดำเนินการใน cloacal และswabs เชอรี่ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (วอร์ด et al., 2004) ระบบ LC MagnaPure กับ MagnaPure รวมกรดนิวคลีชุดแยก(Roche Diagnostics, Almere เนเธอร์แลนด์) ถูกใช้เพื่อแยกอาร์เอ็นเอ ABI 7500 ลำดับที่ระบบตรวจจับด้วยTaqMan EZ RT-PCR หลักชุดรีเอเจนต์ (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den Ijssel, เนเธอร์แลนด์) ถูกนำมาใช้เพื่อดำเนินการวิเคราะห์real time RT-PCR ในการตรวจสอบโรคไข้หวัดใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 เป็ดตั้งค่า
ทดลองระบุเป็นรายบุคคลและแบ่งออกเป็นสองกลุ่มที่มีสี่สัตว์

แต่ละทดลอง และกลุ่มควบคุม แต่ละกลุ่มอยู่กันในทางลบ
ดันแยกหน่วย ได้รับน้ำและอาหารหยาบและสามารถโฆษณา
5 วัน ก่อนการปลูกเชื้อ
เป็ดในกลุ่มทดลองที่ใส่รวม
เชื้อ 1
104 tcid50 ของไวรัสใน 3 ml พีบีเอส ซึ่งเป็นเชื้อ intratracheally 1.5 ml
intraesophageally 1.5 ml .
ใช้เหมือนกับที่ใช้โดย keawcharoen et al . ( 2008 )

ให้เปรียบเทียบกับการศึกษาที่ซึ่งใน dose ต่ำได้
เลือกจำลองสภาวะและเพิ่มโอกาสของการติดเชื้อ
การผลิตที่มีประสิทธิภาพโดยไม่โรคทางคลินิก 4
เป็ดในกลุ่มควบคุมเสแสร้งใส่ในปริมาณเดียวกัน

และเส้นทางเดียวกัน น้ำหนักของเป็ดคือบันทึกประจำวัน พฤติกรรมที่ผิดปกติ และอาการเครียดที่ถูกบันทึกไว้ทุกวัน ตามขั้นตอนมาตรฐาน
โดยสัตวแพทย์ ตรวจสอบ , ไวรัส , และการเก็บรวบรวมจากคอหอย cloacal

ระดับ แบ่งเป็น รายวันสามเฉยๆและแช่แข็งที่ 70  C ต่อมาไวรัสแยก
ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบย้อนกลับ ( RT-PCR ) เลือด
รวบรวมสำหรับแปลงชนิดแยก 5 วันก่อน
เชื้อสาเหตุ และในวัน . เป็ดทั้งหมดถูก euthanized
โดยเลือดที่ตกค้างใต้ Isoflurane ยาชา 4 จุดต่อนิ้วหรือก่อนหน้านี้ถ้า
พวกเขาพัฒนาอาการรุนแรง ( เป็ด ) necropsies ถูก
การดําเนินการและตัวอย่างเนื้อเยื่อ ศึกษาด้านการเปลี่ยนแปลงของหลอด (
, งานวิจัยและ ) , และการแยกเชื้อไวรัส การศึกษา
ได้รับการอนุมัติโดยอิสระและดูแลสัตว์คณะกรรมการใช้
, เนเธอร์แลนด์ ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3
.
2.4 . พยาธิวิทยา จุลกายวิภาคศาสตร์ และหลอด ( งานวิจัยและ )
เนื้อเยื่อต่อไปนี้ถูกรวบรวมเพื่อการเปลี่ยนแปลง : กลาง
ช่องจมูก Concha , caudal ช่องจมูก Concha harderian , ต่อม , ตา , สมอง ,
สาขาจักษุของเส้นประสาทไทรเจมินัลถุงลม ( ซ้ายและขวา , ซ้ายและขวาด้านหลัง
ปากมดลูกและช่องอกและช่องท้อง ) ,
หลอดลม , ปอด ( ซ้าย และขวารวมถึงหลอดลมหลัก ) , หลอดอาหาร ,
proventriculus ใหญ่บริเวณกระเพาะอาหารก่อน ( มาตราผ่านลำไส้ , ,
ส่วนกลาง ) , สามส่วนของเดือน meckel ของสภาวัฒนธรรมแห่งชาติ ileo
, ลำไส้ใหญ่ซีคัมชุมทาง , ลําไส้ใหญ่ ( ส่วนผ่านส่วนกลาง ) , Bursa ของ
Fabricius , ตับ , ไต , ม้าม , หัวใจ , กล้ามเนื้อ , ผิวหนังหน้าอกต่อมบ่งเพศ ,
( อัณฑะหรือรังไข่ต่อมหมวกไตต่อมไธมัส , ต่อมไทรอยด์และไขกระดูก .
ตัวอย่างง มันถูกแบ่งออกเป็น 5 ส่วนเท่า
3 8-cm-long แถบถ่ายหนึ่งจากแต่ละก่อน ( ส่วนใหญ่
ใกล้เคียง ) , 3 ( กลาง ) และห้า ( distal ที่สุด ) ส่วน