C. Cultural and isolation procedure

C. Cultural and isolation procedures
Prepare Gram stain of sample and examine for large Gram-positive rods.
Plate count of viable C. perfringens. Using aseptic technique, place 25 g food sample
in sterile blender jar. Add 225 ml peptone dilution fluid (1:10 dilution). Homogenize 1-2
min at low speed. Obtain uniform homogenate with as little aeration as possible. Using
1:10 dilution prepared above, make serial dilutions from 10-1 to 10-6 by transferring 10-
90 ml peptone dilution fluid blanks. Mix each dilution thoroughly by gently shaking
before each transfer. Pour 6-7 ml TSC agar without egg yolk into each of ten 100 x 15
mm petri dishes and spread evenly on bottom by rapidly rotating dish. When agar has
solidified, label plates, and aseptically transfer 1 ml of each dilution of homogenate to
the center of duplicate agar plates. Pour additional 15 ml TSC agar without egg yolk into
dish and mix with inoculum by gently rotating dish.
An alternative plating method preferred for foods containing other types of sulfitereducing
organisms is to spread 0.1 ml of each dilution with sterile glass rod spreader
over previously poured plates of TSC agar containing egg yolk emulsion. After
inoculum has been absorbed (about 5 min), overlay plates with 10 ml TSC agar without
egg yolk emulsion. When agar has solidified, place plates in upright position in
anaerobic jar. Establish anaerobic conditions and place jar in 35°C incubator for 20-24 h.
(TSC agar containing egg yolk is incubated 24 h.) After incubation, remove plates from
anaerobic jar and select those containing 20-200 black colonies for counting. C.
perfringens colonies in egg yolk medium are black with a 2-4 mm opaque white zone
surrounding the colony as a result of lecithinase activity. Using Quebec colony counter
with white tissue paper over counting area, count black colonies and calculate number of
clostridia cells/g food. Save plates for identification tests (see D, below).
Prepare chopped liver broth (or cooked meat medium) for inoculation by heating 10 min
in boiling water or flowing steam and cooling rapidly without agitation. Inoculate 3 or 4
broth tubes with 2 ml of 1:10 homogenate as back-up for preceding plating procedure.
Incubate these tubes 24-48 h at 35°C in standard incubator. Disregard if plate counts for
viable C. perfringens are positive.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

C. ขั้นตอนการแยกทางวัฒนธรรมและ
เตรียมกรัมสีของตัวอย่างและตรวจสอบสำหรับแท่งแกรมบวกที่มีขนาดใหญ่.
นับจานของที่ทำงานได้ C. perfringens การใช้เทคนิคปลอดเชื้อ 25 กรัมวางตัวอย่างอาหาร
ในโถปั่นผ่านการฆ่าเชื้อ เพิ่ม 225 มล. น้ำเจือจางเปปโตน (1:10 เจือจาง) ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน 1-2
นาทีที่ความเร็วต่ำ ขอรับ homogenate เครื่องแบบที่มีอากาศน้อยที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ ใช้
01:10 เจือจางเตรียมข้างต้นทำให้เจือจางอนุกรม 10-1 ไป 10-6 โดยการโอน 10
90 มล. เปปโตนช่องว่างของเหลวเจือจาง ผสมเจือจางแต่ละอย่างละเอียดโดยการเขย่าเบา ๆ
ก่อนที่จะโอนในแต่ละ เทวุ้นทีเอสซี 6-7 มล. โดยไม่ต้องไข่แดงในแต่ละสิบ 100 x 15
มมอาหารเลี้ยงเชื้อและการแพร่กระจายอย่างเท่าเทียมกันที่ด้านล่างโดยการหมุนจานอย่างรวดเร็ว เมื่อวุ้นได้
ผลึกแผ่นป้ายและการถ่ายโอนปลอดเชื้อ 1 มิลลิลิตรของการลดสัดส่วนของ homogenate แต่ละ
ศูนย์ของแผ่นวุ้นที่ซ้ำกัน เทอีก 15 มล. วุ้นทีเอสซีโดยไม่ต้องไข่แดงลงไปใน
จานและผสมกับเชื้อโดยละม่อมหมุนจาน.
วิธีการชุบทางเลือกที่แนะนำสำหรับอาหารที่มีชนิดอื่น ๆ ของ sulfitereducing
ชีวิตคือการกระจาย 0.1 มิลลิลิตรเจือจางแต่ละคนมีก้านแก้วกระจายผ่านการฆ่าเชื้อ
มากกว่าแผ่นเทก่อนหน้านี้ ของวุ้นทีเอสซีที่มีอิมัลชั่ไข่แดง หลังจาก
เชื้อได้รับการดูดซึม (ประมาณ 5 นาที) แผ่นซ้อนทับกับวุ้นทีเอสซี 10 มล. โดยไม่ต้อง
อิมัลชันไข่แดง เมื่อวุ้นแข็งตัวแผ่นขึ้นในตำแหน่งตั้งตรงใน
ขวดแบบไม่ใช้ออกซิเจน สร้างเงื่อนไขแบบไม่ใช้ออกซิเจนและขวดขึ้นใน 35 ° C เป็นศูนย์บ่มเพาะ 20-24 ชม.
(วุ้นทีเอสซีที่มีไข่แดงเป็นบ่ม 24 ชั่วโมง.) หลังจากการบ่มเอาแผ่นจาก
ขวดเพาะกายและเลือกผู้ที่มี 20-200 โคโลนีสีดำสำหรับการนับ C.
perfringens อาณานิคมในกลางไข่แดงมีสีดำกับสีขาวขุ่น 2-4 มมโซนสีขาว
รอบอาณานิคมเป็นผลมาจากกิจกรรม lecithinase การใช้เคาน์เตอร์อาณานิคมควิเบก
ด้วยกระดาษทิชชูสีขาวไปทั่วพื้นที่นับนับโคโลนีสีดำและคำนวณจำนวน
เซลล์ clostridia / g อาหาร แผ่นบันทึกไว้สำหรับการทดสอบประจำตัวประชาชน (ดูด้านล่าง).
เตรียมน้ำซุปตับสับ (หรือขนาดกลางเนื้อสุก) สำหรับการฉีดวัคซีนด้วยความร้อน 10 นาที
ในน้ำเดือดหรือไหลไอน้ำและระบายความร้อนได้อย่างรวดเร็วโดยไม่ต้องปั่นป่วน ฉีดวัคซีน 3 หรือ 4
ท่อน้ำซุป 2 มิลลิลิตร 01:10 homogenate เป็นสำรองสำหรับขั้นตอนก่อนหน้าชุบ.
บหลอดเหล่านี้ 24-48 ชั่วโมงที่ 35 องศาเซลเซียสในศูนย์บ่มเพาะมาตรฐาน ไม่สนใจถ้านับจานสำหรับ
perfringens ทำงานซีเป็นบวก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

C . วัฒนธรรมและการแยกขั้นตอน
เตรียมกรัมคราบของตัวอย่างและตรวจสอบสำหรับขนาดใหญ่ แกรมบวกแท่ง สาย C . perfringens
จานนับ . การใช้เทคนิคปลอดเชื้อ วาง 25 กรัมในตัวอย่างอาหาร
เป็นหมันเครื่องปั่นจา เพิ่ม 225 มิลลิลิตร ตามลำดับการเจือจาง ( 1 : 10 ( ของเหลว ) โฮโมจิไนซ์ 1-2
มินที่ความเร็วต่ำ ขอรับชุดแยกเป็นส่วนเล็กน้อยที่สุด ใช้
110 ( เตรียมไว้ข้างต้น ให้ต่อเนื่อง เพื่อสามารถเจือจางจาก 1-10 โดยการโอน 10
90 มิลลิลิตร ตามลำดับ ( ของเหลวในช่องว่าง การผสมแต่ละอย่างละเอียด โดยค่อย ๆสั่น
ก่อนที่แต่ละการถ่ายโอน เท 6-7 ml สารวุ้นไม่มีไข่แดงลงในแต่ละสิบ 100 x 15
มม. จานเลี้ยงเชื้อและกระจายไปด้านล่างอย่างรวดเร็วโดยหมุนจาน เมื่อวุ้นได้
แข็ง , ฉลากแผ่นโอนแล้ว aseptically 1 มิลลิลิตรของแต่ละระดับการเจือจางของอน

กลางแผ่นวุ้นที่ซ้ำกัน รินเพิ่มเติม 15 ml สารวุ้นไม่มีไข่แดงในจานเลี้ยงเชื้อผสมด้วย

โดยค่อย ๆหมุนจาน ทางเลือกชุบวิธีการที่ต้องการสำหรับอาหารที่มีชนิดอื่น ๆของ sulfitereducing
สิ่งมีชีวิตคือการกระจายของแต่ละระดับ 0.1 มิลลิลิตรผ่านแท่งแก้วกระจาย
ไปก่อนหน้านี้เทลงจานอาหารที่มีสารผสมไข่แดง หลังจาก
3 ได้ดูดซึม ( ประมาณ 5 นาที ) ซ้อนทับแผ่น 10 ml สารวุ้นโดยไม่
ไข่แดง อิมัลชั่น เมื่อวุ้นแข็งตัว วางจานในตำแหน่งตั้งตรงใน
anaerobic jar . สร้างเงื่อนไข anaerobic jar 35 ° C และสถานที่ในศูนย์บ่มเพาะสำหรับ 20-24 h .
( TSC วุ้นที่มีไข่แดงเป็นบ่ม 24 ชั่วโมง) หลังจากบ่มเอาแผ่นจาก anaerobic jar
และเลือกที่มี 20-200 โคโลนีสีดำสำหรับนับ C . perfringens ในอาหาร
อาณานิคมไข่แดงมีสีดำกับสีขาวขุ่น 2-4 มม. โซน
รอบอาณานิคมเป็นผลของกิจกรรมเลซิทิเนส . ใช้นับกระดาษเนื้อเยื่อควิเบกอาณานิคม
กับสีขาวมากกว่านับพื้นที่นับโคโลนีสีดำและคำนวณจำนวน
Clostridia เซลล์ / กรัมอาหาร บันทึกแผ่นการทดสอบการเห็นด้านล่าง ) .
เตรียมซุปตับสับ ( หรือเนื้อสุกปานกลาง ) สำหรับการฉีดวัคซีนโดยความร้อน 10 นาที
ในน้ำร้อนหรือไอน้ำและความร้อนไหลได้อย่างรวดเร็วโดยไม่ต้องเขย่า ฉีดวัคซีน 3 หรือ 4
2 ml ของน้ำท่อแยกเป็น 10 ปีที่ผ่านมากระบวนการชุบท่อเหล่านี้ 24-48 H .
ฟักไข่ 35 °องศาเซลเซียสในตู้อบมาตรฐานไม่สนใจถ้าได้ C . perfringens จานับ

เป็นบวก